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时间:2018-11-16
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1、助孕3号方对肾虚黄体不健流产大鼠TCRγδT细胞的影响论文【摘要】观察补肾健脾中药助孕3号方对肾虚黄体不健流产大鼠T淋巴细胞抗原识别受体(TCRγδT)的影响。【方法】将SD大鼠40只随机分为5组,即空白对照组,模型组,助孕3号方高、低剂量组(中药高、低剂量组,剂量分别为7.08、3.54g·kg-1·d-1),多力玛组(剂量为1.5mg·kg-1·d-1);除空白对照组外,其他组均采用羟基脲(剂量为450mg·kg-1)联合米非司酮(剂量为3.75mg·kg-1)复制肾虚黄体不健流产模型。观察各组大鼠的子宫质量、胚胎数及流产情况,采用流式细胞仪检测外
2、周血TCRγδT及CD3+T淋巴细胞水平。【结果】模型组大鼠子宫质量、孕胎数显著性降低.freelajorhistopatibilityplex,MHC)Ⅰ类抗原的受体。研究认为[1]TCRγδT细胞在识别胚胎抗原中起关键作用,并决定与胚胎抗原反应的质量,从而影响妊娠结局。本研究拟以羟基脲复制肾虚黄体不健大鼠流产模型,观察助孕3号方对TCRγδT细胞的影响,以探讨该方的保胎机制,现报道如下。1材料与方法1.1动物雄性10~12周龄SPF级SD大鼠,雌性8~10周龄SPF级SD大鼠,体质量约200~250g。购自广州中医药大学实验动物中心,合格证号为N
3、O.0009247。1.2药物、试剂与仪器羟基脲为北京红惠生物制药股份有限公司产品,批号:20013389;多力玛(5mg烯丙雌醇/片)为匈牙利吉瑞大药厂产品,批号:20020213;米非司酮为上海华联制药有限公司生产,批号:H10950347。助孕3号方由菟丝子、桑寄生、续断、黄芪、党参、女贞子等组成,提取工艺流程(由珠江医院提取加工)为药材洗净,第1次加10倍量水浸泡30min,提取2h,滤过;第2次加8倍量水提取2h,滤过,合并2次滤液,真空浓缩,真空度为0.08~0.085mPa;浓缩至1.5倍药材体积时,高速离心,转速1500r/min;上清
4、液浓缩至比重为1.18;喷雾干燥,参数为温度180℃,出风温度90℃,流量500mL/min;最后得膏8.5kg,得膏率为8.5/32.76=25.9%。大鼠每种药物的用量根据大鼠用药人鼠换算公式计算而得。溶血素、藻红蛋白(phycoerythrin,PE)抗γδTCR单克隆抗体、异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)抗CD3单克隆抗体均购自深圳晶美生物工程有限公司。ALTRA流式细胞仪为美国BECKMANCOULTER公司产品。1.3分组、造模[2]、给药及观察指标将SD大鼠雌雄合笼,每日晨阴道涂片,以发现大量
5、精子者作为妊娠第1天。将雌性受孕大鼠随机分为5组,每组8只。除空白对照组外,其他组均于妊娠第1至第7天以羟基脲灌胃(450mg·kg-1·d-1),第7天时灌服米非司酮(3.75mg·kg-1),复制肾虚黄体不健流产模型。造模同时,助孕3号方高、低剂量组(中药高、低剂量组)分别以7.08、3.54g·kg-1·d-1的剂量灌胃给药,多力玛组以1.5mg·kg-1·d-1的剂量灌胃给药,模型组与空白对照组灌服等容积生理盐水,均连续7d。灌服米非司酮24h后,以乙醚麻醉,眼眶后静脉丛取血,用乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)抗凝管取500μL新鲜全血,1h内采
6、用流式细胞仪检测TCRγδT细胞水平。1.4TCRγδT水平检测EDTA抗凝的新鲜大鼠外周全血50μL,分别加入10μLFITC抗CD3单克隆抗体、PE抗γδTCR单克隆抗体,混匀,避光孵育20min;加入1倍流式细胞检测剂2mL混匀,室温避光孵育10min,直至液体澄清透明;1000r/min离心5min,弃上清;将细胞悬浮于0.5mL磷酸盐缓冲溶液(PBS)中,振荡混匀后上机检测。在流式细胞仪上,以氩离子激光波长488nm为激发光,以FSC/SSC二维散点图设门于淋巴细胞群体进行检测,用ExPo32采集分析软件对数据进行分析。1.5统计处理采用SP
7、SS11.0统计学分析软件进行数据处理。2结果2.1各组大鼠一般情况、子宫质量、胚胎数及流产情况除空白对照组外,各组妊娠大鼠灌服羟基脲后都有不同程度的毛松、毛干枯、弓背、蜷卧、活动力下降、纳食减少等症状,各组大鼠大便未见明显异常。表1结果表明,模型组大鼠子宫质量、孕胎数显著性降低,流产率显著性升高(P<0.01);中药高、低剂量组均可升高子宫质量及孕胎数,降低流产率,与模型组比较有显著性差异(均P<0.05或P<0.01),且呈现一定的剂量效应关系,其作用与孕激素多力玛相似。2.2各组大鼠TCRγδT细胞、CD3+T淋巴细胞表达情况比较见表2、图1。表
8、2结果表明,模型组大鼠外周血中CD3+T细胞水平显著性升高,提示体内细胞免疫过度,从而对妊娠带
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