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1、人参皂苷Rg1、Rb1对淀粉样前体蛋白分泌酶代谢途径的影响论文.freelyloidprecursorprotein；Alzheimer’sDiseaseβ-淀粉样蛋白(beta-amyloidprotein,Aβ)在细胞外沉积构成的老年斑是阿尔茨海默病(Alzheimer’sDisease,AD)主要病理学特征之一。Aβ由淀粉样前体蛋白(amyloidprecursorprotein,APP)经α和β两种分泌酶裂解产生。有效地调整分泌酶活性和功能是防治AD的重要途径。人参皂苷Rg1、Rb1是人参的主要有效成分。有报道,.freelLG418、2.5μ
2、g/mLPuromycin。1.2试剂及药物天然药物单体标准品人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1均购自中国药品生物制品检定所。ADAM9小鼠抗人单克隆抗体(批号ENM0139091)、ADAM10小鼠抗人单克隆抗体(批号FAL02)均购于美国RD公司。辣根过氧化物酶(HRP)耦联羊抗小鼠二抗和羊抗兔二抗(批号73452)。RT-PCR试剂盒(批号18080-051)购于美国Invitrogen公司。总RNA提取试剂盒(批号18341)购于美国Promega公司。α分泌酶活性检测试剂盒(批号FP001)为美国RD生物公司出品。2实验方法2.1总RNA提取按照
3、RNAgentsTotalRNAIsolationSystem(Promega)试剂盒和superscriptTIMⅢFirst-StrandSynthesisforRT-PCR试剂盒操作,提取总RNA并完成RT-PCR。Beta-actin扩增产物作为内参,所用引物由上海Sangon生物工程服务有限公司合成。引物的碱基序列及扩增的目的基因片段长度如下：①BACE1(上游：5’-AAGATGTTCGGAATGTGGGT-3’；下游：5’-CAGGGCTACTATGTGGAGATGA-3’)。②ADAM9(上游：5’-AGTTCCTGGACCCTGATG
4、C-3’；下游：5’-TTCTCCCGCAGACCCGCTAC-3’)。③ADAM10(上游：5’-CACTTGGCTTATGTTCCTA-3’；下游：5’-CTGCTTGGCCTATGTCTTC-3’)。用Fluochemy5500凝胶图像分析仪采集图像,经ImageMasterTMTotalLabSoftin,弃上清。以50×106cells/mL比例加入冷1×CellExtractionBuffer裂解细胞。冰浴20min后,10000g离心1min,取上清液,放置冰上备用。在黑色避光微量培养板各孔内依次加入50μL细胞裂解液(蛋白量40μg),
5、50μL2×ReactionBuffer及5μL酶促底物。轻轻敲动培养板混匀,37℃避光孵育2h。利用荧光全自动定量绘图酶标仪,在激发波长335nm、收集波长495nm检测样本。实验设6个空白对照,分别为空板、不加细胞裂解液、不加酶促底物。2.39一抗(或ADAM10),同时1∶500加入小鼠抗人β-actin单克隆抗体,4℃过夜。再加入HRP耦联羊抗小鼠二抗(1∶2000)、羊抗兔二抗(1∶2000),室温孵育2h,用化学发光法(ECL)检测结果。蛋白表达条带通过Bandscan图像分析软件进行分析。2.4统计学方法实验结果采用SPSS11.5分析软
6、件中方差分析进行统计。其中免疫印迹、RT-PCR图像光密度(OD)值均与突变型基因细胞组最大值相比,进行数据的标准化处理后再进行数据统计分析。3结果3.1α分泌酶活性测试结果加用人参皂苷Rg1、Rb1组与未加用组组间差异有统计学意义(F＝2.975,P0.05),其中转染突变型PS1ML46L(control)组α分泌酶活性较转染野生型PS1(9扩增条带长度约为525bp,ADAM10扩增条带约为394bp。加用人参皂苷Rg1、Rb1组与未加用组组间差异有统计学意义(FADAM9＝3.294,P＝0.011；FADAM10＝9.345,P＝0.000)
7、。其中转染突变型PS1ML46L细胞ADAM9、ADAM10mRNA表达较转染野生型PS1(L46L细胞中加用人参皂苷Rb1、Rg1组与未加用人参皂苷组相比,ADAM9mRNA表达增多(P0.05)。ADAM10mRNA表达检测中,转染突变型PS1ML46L细胞中加用人参皂苷Rb1、Rg1组中的ADAM9mRNA表达亦高于未加用人参皂苷组(P0.05)。3.3分泌酶测试结果ADAM9蛋白条带在分子量84kDa左右,ADAM10蛋白条带在分子量60kDa左右(见图1)。不同组细胞分析结果显示各组组间差异有统计学意义(FADAM9＝4.543,P0.05；
8、FADAM10＝4.543,P0.05)。突变型PS1ML46L组ADAM9蛋白表达量较转染野
