冬凌草甲素通过激活caspase途径诱导人乳腺癌mda

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1、冬凌草甲素通过激活caspase途径诱导人乳腺癌MDA作者：江永青,熊向阳,余乐涵【摘要】　　目的研究冬凌草甲素诱导人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的作用原理及caspase途径在凋亡过程中的作用。方法噻唑蓝(MTT)法,形态学观察,RT-PCR及流式细胞法。结果冬凌草甲素对MDA-MB-231细胞生长抑制作用呈时间剂量依赖性。形态学观察可见MDA-MB-231的增殖受明显抑制。冬凌草甲素可诱导细胞内抑制凋亡基因Bc1-xl表达量时间依赖性减少，促凋亡基因Bid表达量增加，caspase-3

2、的表达增加。40μmol/L药物处理48h后，流式法检测细胞凋亡率为75%。结论冬凌草甲素诱导MDA-MB-231细胞凋亡,这种作用可能是通过改变Bc1-xl/Bid的表达比率、激活caspase-3而实现的。【关键词】冬凌草甲素MDA-MB-231细胞凋亡Bc1-xl/Bidcaspase-3　　Abstract：ObjectiveTostudythemechanismsoforidonin-inducedhumanbreastcancerMDA-MB-231cellapoptosis，and

3、toexaminetheroleofcaspasepathorphology,RT-PCRandfloetry．ResultsOridonininhibitedMDA-MB-231cellgroe-anddose-dependentmanners,decreasedtheexpressionofantiapoptoticmitochondrialgenebcl—xltime-dependently，andincreasedtheexpressionofproapoptoticgenebidand

4、caspase-3．Theapoptosisrateetryaftertreatmentfor48hoursattheconcentrationof40μmol/L.ConclusionOridoninmaybeinduceMDA-MB-231cellapoptosisthroughalternationoftheratioofBc1-xl/Bidandactivationofcaspase-3.　　Keyresco公司）；RT试剂盒（美国Fermentas公司）。15AC5%CO2的培养箱（美

5、国SANYO公司）；GeneGenius全自动凝胶成像分析系统(英国Syngene公司)；4314型倒置显微镜（美国Cioc）；Facscallbar流式细胞仪（美国BectonDickinson公司)。　　2方法　　2.1细胞培养MDA-MB-231细胞，在含10%胎牛血清的HyQ改良型1640培养基，37℃、5%的CO2饱和湿度培养箱中培养。　　2.2细胞毒实验（MTT法）取对数生长期的MDA-MB-231细胞200μl接种于96孔板中（2×104个/ml），培养48h后加入不同浓度的冬凌草

6、甲素(用DMSO溶解,其浓度<0.01%)，每个药物浓度设5个平行复孔，另设DMSO对照组(DMSO浓度为0.01%)和正常对照组。分别培养24，48，72h，到终止培养前4h，每孔加入MTT（5μmol/L）20μl，继续培养4h后终止培养，小心吸出孔内上清液，每孔加入DMSO150μl，用震荡混合仪震荡10min，使结晶充分溶解。选择490nm波长酶标仪测定每孔光吸收值(OD值)。按公式计算抑制率：抑制率(%)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。用IC50软件算出IC50值

7、（细胞抑制率为50%时的药物浓度）。MTT实验证实OMSO＜0.01%，对细胞无抑制作用，以下各组实验均以DMSO组为对照组（OMSD＜0.01%）。　　2.3细胞形态学观察以每孔2×104个/ml细胞密度接种于6孔板中，培养24h后，空白对照组和冬凌草甲素4个剂量组分别加入浓度为0，5，10，20，40μmol/L冬凌草甲素。72h后在倒置显微镜下观察细胞形态学变化。　　2.4半定量RT-PCR检测相关基因的表达变化取经药物作用48h后各实验组的MDA-MB-231细胞，按TrizolReag

8、ent试剂盒说明书提取MDA-MB-231细胞总RNA，按照RT试剂盒（美国Fermentas公司）的说明操作，进行RT-PCR。引物设计借助引物设计软件PrimerPremier5.0设计正义和反义引物。见表1。表1RT-PCR引物序列（略）　　反应条件：Bcl-xl:94℃3min;94℃45s,55℃45s,72℃45s，35个循环；结束前72℃延伸10min。Bid:94℃3min;94℃45s,56℃45s,72℃45s，35个循环；结束前72℃延伸10min。caspase-3:94