胃肠舒对大鼠胃肠平滑肌细胞钙离子浓度的影响

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1、胃肠舒对大鼠胃肠平滑肌细胞钙离子浓度的影响【摘要】目的通过测定体外培养的SD大鼠胃肠平滑肌细胞内游离Ca2+浓度，观察胃肠舒对SD大鼠胃肠平滑肌细胞内游离Ca2+浓度的影响，探讨胃肠舒促胃肠动力的作用机制。方法离体培养SD大鼠胃肠平滑肌细胞，应用特异性Ca2+荧光探针Fura-2AM负载细胞，激光共聚焦显微镜检测游离Ca2+浓度。结果胃肠舒在25、50、100mg/ml时均可升高胃肠平滑肌游离Ca2+浓度，且随剂量增加而加强。结论胃肠舒具有升高胃肠平滑肌细胞游离Ca2＋的作用，Ca2+作为细胞内第二信使

2、可能参与了胃肠舒促进胃肠平滑肌细胞的动力机制。【关键词】胃肠舒；胃肠平滑肌细胞；Ca2+浓度；Fura-2AM；激光共聚焦显微镜【Abstract】ObjectiveToobserveethodsSDratgastrointestinalsmoothmusclecellseasuredbyfluorescentintensityineachgroupcellicroscope.Results25,50,100mg/ml,laserscanningconfocalmicroscope胃肠运动障碍型疾病是临

3、床多发病，多与胃肠蠕动功能减弱有关，是一类无法用解剖结构异常来解释的临床疾病，其主要病理生理基础为胃排空延迟及小肠传输功能障碍［１,２］，现临床最常用的促胃肠动力药促进胃肠蠕动虽然有较好疗效，但其副作用如药理作用受限、催乳素增加、焦虑、激动、运动性不安、共济失调、腹泻、腹痛等不可忽视。目前胃肠运动障碍型疾病由于发病机制尚不清楚［3,4］，其药物的研发受到限制，因此研究该类疾病的调控机制，为开发中药新药提供科学的数据非常重要［5］。胃肠舒是本课题组研究人员根据《伤寒论》大承气汤、小承气汤、调胃承气汤三方化

4、裁，取大黄、枳壳、甘草组方，经临床反复药物筛选研制而成的纯中药制剂，可起到有效促进胃肠动力的作用［6,7］。本研究选取SD大鼠胃肠组织进行原代细胞培养，构建胃肠平滑肌细胞模型，不同浓度的胃肠舒作用后，测定用药后胃肠平滑肌细胞内游离Ca2+浓度的变化，初步探讨了胃肠舒促进胃肠动力的分子机制。1材料与方法1.1材料胃肠舒由滨州医学院附属医院制剂室提供；西沙必利由浙江京新药业股份有限公司生产；标准SD大白鼠由烟台绿叶实验动物中心提供；DMEM培养基购自GiBco公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料公司；F

5、ura-2AMCa2+荧光探针购自碧云天生物技术研究所；牛血清白蛋白购自碧云天生物技术研究所；HERACO2培养箱；TCSSPE激光扫描共聚焦显微镜。1.2方法1.2.1离体胃肠平滑肌细胞的培养：选择标准SD大白鼠，体质量180～200g，雌雄各半，乙醚麻醉，剖腹后迅速剪取胃体、空肠组织，PBS清洗后剪碎，去除上清液，重复清洗2～3次。将盛有组织碎片的容器置于冰上，去除残留的上清液，加入0.25％胰蛋白酶，在4℃孵育6～18h。移弃组织碎片中的胰蛋白酶，在37℃孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片20到30m

6、in。待小块组织完全消化溶解后，过200目网，1000r/min离心7min。弃上清液，向细胞沉淀中加入新鲜配制含20%胎牛血清的DMEM培养液，轻轻吹打，后按每瓶(25ml)3×104活细胞接种在培养瓶里，放入37°C孵箱里静置培养待测，CK×41倒置相差显微镜观察拍照。1.2.2平滑肌细胞的鉴定：将处理好的盖玻片，放入6孔板使之与孔底贴合紧密，进行细胞培养。细胞生长至第5代吸去培养液，先用PBS洗涤已贴壁盖玻片2～3次。95%酒精室温固定20min，PBS洗2～3次。0.1%TritonX-100室

7、温孵育20～30min增强细胞通透性。正常羊血清于37℃封闭20min。滴加一抗兔抗鼠α-actin单克隆抗体（1∶200，购自Sigma公司）室温过夜，滴加二抗羊抗兔FITC-IgG（1∶100），37℃孵育2h，倒置荧光显微镜（波长500nm）观察拍照。1.2.3胞内钙离子浓度测定：实验分为5组，分别为空白对照组、西沙必利对照组（0.51mg/ml）、胃肠舒小剂量组Ⅰ组（25mg/ml）、胃肠舒中剂量组Ⅱ组（50mg/ml）、胃肠舒大剂量组Ⅲ组（100mg/ml）。D-Hanks液吹打6孔板中培养的

8、胃肠平滑肌细胞，用移液枪吸取1ml细胞悬液于1.5ml离心管中进行Fura-2AM荧光探针的负载。胞内钙离子测定方法胞内Ca2+浓度升高的途径可能有三条：①胞内肌浆网内Ca2+的释放(可通过肌浆网Ca2+释放阻断剂TMB-8进行验证)；②胞外Ca2+通过胞膜的Ca2+通道发生内流(可通过Ca2+通道阻断剂EGTA或拉西地平进行验证)；③两种途径同时存在。胃肠舒促使Ca2+浓度的升高是通过哪一条途径及其其他的影响因素正在进一步研究中。【