细胞型朊蛋白（prpc）受体或受体源的筛选论文

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1、细胞型朊蛋白（PrPc）受体或受体源的筛选论文.freelolecule;cerebellargra-nuleneuronsAbstract:AIMToexpress，arebinantproteinPrPAPcontainingtheextracellularpartofprionproteinandalkalinephosphatase（AP）inasecretedformintheculturesuper-natant.andtouseitasaligandtosearchforrecep

2、tors（orbindingproteins）forprionproteinthroughbindingassay.METHODSAPhistochemistryolecules，culturedoligodendrocytesandScharycul-turedcerebellargranuleneurons.TheculturesupernatantcontainingAPongthecelladhesionmoleculesde-tected，onlyNCAM140shobiguouspo

3、sitivebinding，theothermoleculesL1，CHL1，P0，Tag，F3andPrPhadnobindingately20%positivebinding，thebindingrateforoligoden-drocytesaryculturedcerebel-largranuleneuronshadalmost100%cellsbindingaterialforthefurtherseparationofreceptorsforprionprotein.It’simpl

4、iedthatcerebellummighthaveacloserelationshipine（LifeTechnolo-gies，Germany），细胞培养液成分（LifeTechnolo-gies，Germany），PrP抗体（Charles（120，140，180），P0，PrP（德国汉堡大学分子神经生物研究所提供）;④动物:C57BL/6J野生型小鼠（德国汉堡大学分子神经生物研究所动物中心提供）.1.2方法①表达PrPAP和AP:以Lipofec-tamine转染PrPAP质粒至293-

5、EBNA细胞中，48h后，收集细胞培养液，同时培养表达碱性磷酸酶（AP）的细胞并收集培养液，以ELISA法检测PrP和AP活性;②粘附分子的表达:同样以Lipofectamine分别将L1，CHL1转染到L929细胞中，F3，Tag转染到CHO细胞中，NCAM（120，140，180），P0，PrP至COS-1细胞中，并且以略去相应DNA的模拟转染细胞作为对照;③细胞系的培养:少突胶质细胞系OLN-93以DMEM，100mLL-1FCS，5×103UL-1青霉素和50mgL-1链霉素培养液37℃

6、，50molL1CO2孵育箱内培养至细胞80%铺满.雪旺氏细胞系S16以DMEM，100mLL-1FCS，50mgL-1庆大霉素培养液37℃，50molL-1CO2孵育箱内培养至细胞80%铺满;④原代小脑颗粒细胞培养:小脑颗粒细胞培养自6～8d的C57BL/6J野生型小鼠小脑，方法依据文献［2］，细胞重悬和培养于无血清培养液加1gL-1BSA，2.2gL-1NaH-CO3，100mgL-1Na2CO3，27IUL-1抑肽酶，5IUL-1青霉素，50mgL-1链霉素;⑤粘附分子、细胞系及原代培养细

7、胞和PrPAP的结合实验方法参照文献［3］.将细胞和含PrPAP的细胞培养液室温孵育75min，以含AP的细胞培养液作为对照，然后依次进行洗涤、固定、内源性磷酸酶灭活及以NBT/BCIP为底物的碱性磷酸酶的组织化学反应.阳性对照为KitAP及其细胞表面表达受体的结合［4］.2结果2.1对所表达的PrPAP的检测经PrP抗体和以NBT/BCIP为底物的对AP活性的ELISA反应，表明所收集的转染细胞培养液含有所需浓度的PrPAP，可用于细胞结合实验.2.2粘附分子和朊蛋白结合仅表达NCAM140的

8、细胞与PrPAP有类似阳性的结合，但经过重复实验，仍不能非常确定，为结论的稳妥性，定为阴性.其它分子未见有阳性结合.2.3细胞系结合实验结果表明在雪旺氏细胞中，有部分细胞显示阳性结合，估计阳性率约20%（Fig1），而少突胶质细胞与朊蛋白呈阳性结合的细胞在整个平皿中约占60%（Fig2），而以表达AP的培养液所作的对照，仅有个别细胞类似阳性染色（Fig3）.2.4小脑颗粒细胞的结合实验结果表明该培养细胞与朊蛋白有非常好的结合，有接近100%的阳性率（Fig4），在高倍镜下可见阳性染色的细节，多数