细胞型朊蛋白受体或结合蛋白在不同发育阶段小鼠脑内

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1、细胞型朊蛋白受体或结合蛋白在不同发育阶段小鼠脑内【关键词】细胞型朊蛋白关键词:细胞型朊蛋白;受体;免疫组织化学摘要:目的表达和纯化以朊蛋白（PrP）胞外部分与人IgGFc段构建的融合蛋白PrPFc，并以此为配体蛋白，定位细胞型朊蛋白（PrPc）的受体在小鼠不同发育阶段脑内的分布.方法收集表达PrPFc的细胞培养液，通过蛋白A-琼脂糖柱亲和层析纯化，以PrPFc纯化蛋白与新鲜弱固定的组织切片反应，免疫组织化学法显示受体在脑内分布模式.结果在正常成年小鼠脑内，细胞型朊蛋白的受体分布以位于大脑皮层（包括新皮层和旧皮层）和纹状体为最多，其次为丘脑、下丘脑及脑干，再次为海马的CA区

2、和齿状回及小脑的蒲肯野和颗粒细胞层，嗅球部位也有一些细胞呈阳性染色;出生后14d小鼠脑内朊蛋白受体与成年动物分布模式及染色强度皆类似，而出生当日及7d后受体分布与14d和成年动物相似，但染色强度明显较弱.结论朊蛋白受体（或结合蛋白）在脑组织有广泛分布;朊蛋白与其受体在脑组织中分布相似.　　Keymunohis-tochemistry　　Abstract:AIMTorebinantproteinPrPFccontainingtheextracellularportionofprionproteinandhumanIgGFcfragmentousebrains.Distrib

3、utionpatternofthebindingproteinsfromdifferentdevelopmentalstagesofmiceediumandpurifiedthroughproteinA-Sepharosecolumn.Theconcentrationandpurityofthefu-sionproteinmunohistochemicalmethodousebrains，cerebralcortexandstriatumhadthehighestlevelofbindingproteins.Thalamus，hypothalamusandbrainste

4、mhadintermediatelevels.CAareaanddentategyrusinhippocampusandPurkinjeandgranulecelllayersincerebel-lumepositivecells.PrPcbindingproteinsinP14mousebrainshadbothsimilardistributionpatternsandstain-ingintensityousebrainsshoilardistributionareasousebrain.Thedistributionpatternofbindingproteins

5、forPrPcissimilaracia），蛋白浓度测定BCA试剂（Pierce，USA），蛋白酶K（Sigma），冰冻切片机（Leica），兔抗Fc（Dianova），羊抗兔IgG（Vector），ABC混合试剂（Vector），C57BL/6J野生型小鼠（德国汉堡大学提供）.　　1.2方法复苏稳定转染的表达分泌型PrPFc的CHO细胞，收集2～4L细胞培养液，经蛋白A-琼脂糖柱亲和层析富集纯化，蛋白经由柱子洗脱后浓缩和浓度测定，取蛋白样品两组，其中一组经蛋白酶K处理，另一组不做处理，经变性SDS-PAGE和in，PBS洗后以PBS配的10gL-1BSA室温封闭1h，将

6、切片分组，以相同摩尔浓度的PrPFc和Fc片段孵育，4℃过夜.次日取出切片以PBS洗涤，然后以兔抗Fc（1100，Dianova）室温孵育2h，PBS洗后再经生物素化的羊抗兔IgG（1100，Vector）室温孵育2h，继以ABC混合试剂（1100，Vector）室温2h，PBS充分洗片后，DAB染色.每步骤后的PBS洗片次数为3次，每次10min.　　图1－图4略　　2结果　　纯化PrPFc的SDS-PAGE和以抗PrP和抗Fc为抗体的Westernblot表明，所得蛋白为PrPFc，且纯度较高.蛋白酶K处理组相应的蛋白条带消失.为排除组织染色由PrPFc中的Fc段引起

7、的假阳性反应，以Fc段作为对照，以相同摩尔浓度与相邻切片反应.由实验结果看，Fc在某些部位有弱染色反应，在分析阳性染色时予以减除.朊蛋白在脑内的受体分布很广泛，从大的脑区分布看，大脑皮层（Fig1A），（包括新皮层和旧皮层）以及纹状体分布最多，阳性细胞密度高，大脑皮层从内层向外层有逐渐增多趋势.其次丘脑、下丘脑以及脑干阳性染色分布也较均匀，仅阳性细胞密度较大脑皮层和纹状体略低.海马和小脑的阳性细胞分布很有特点，海马的CA区和齿状回区染色密集（Fig2A），海马结构的其他区域则仅有稀疏阳性细胞分布.小脑则以蒲肯野细胞层和颗粒细胞