超深低温冷冻与碳化二亚胺交联的同种异体肌腱修复兔跟腱损伤的实验研究

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1、超深低温冷冻与碳化二亚胺交联的同种异体肌腱修复兔跟腱损伤的实验研究方波慈元宗刚大连市第二人民医院，辽宁大连116000[摘要]目的寻找一种新的方法对同种异体肌腱进行进一步的预处理来改善其修复效果，为临床应用提供实验基础和理论依据。方法采用超深低温冷冻法获得兔同种异体肌腱，应用碳化二亚胺对其进行交联并肝素化，检测其组织相容性；将交联组和未交联组肌腱对兔跟腱损伤进行修复，观察并对比不同时间段两组的腱骨愈合情况。结果1、4周EDC交联组炎症反应分级（Ⅰ~Ⅱ）均较未交联组（Ⅲ~Ⅳ）轻，差异有统计学意义(P值分别为0.020、0.030)；移植实验可见交联并肝素化的肌腱在修复跟腱损伤中的愈合能力比未交联

2、的肌腱强，Sharpey’s纤维出现早，缩短了腱骨愈合时间。结论经超深低温冷冻和EDC交联共同处理肌腱，增强其稳定性,降低了同种异体肌腱的免疫原性，促进肌腱与骨的愈合。.jyqkg/kg用戊巴比妥钠静脉麻醉，无菌条件下取兔肌腱，生理盐水反复冲洗浸鲜肌腱置入由10%二甲基亚砜及纯小牛血清组成的冷冻保护液中,室温下平衡后置入液氮罐气液面6h，再浸入液氮中贮存3个月。复苏:40℃水浴快速复温,含10%FCS的RPMI1640液洗涤去除冷冻保护剂后在室温下浸泡在3%过氧化氢中3h后，用蒸馏水反复冲洗3次，30min/次。将其放入１：１氯仿和甲醛混合溶液中脱脂4h,用蒸馏水反复冲洗3次，30min/次。

3、真空冷冻干燥，环氧乙烷消毒备用。1.2同种异体肌腱的交联并肝素化肌腱用50mmol/LMES缓冲液浸泡24h，与EDC交联液（含50mmol/LMES,5mmol/LEDC,5mmol/LNHS,用40%乙醇配制），室温交联6h后，95%乙醇漂洗2次，30min/次,PBS漂洗2次共24h，Hepes缓冲液漂洗4次，20min/次。真空冷冻干燥后,环氧乙烷消毒备用。1.3免疫原性实验选取雄性SD大鼠40只,体重为(250±20)ｇ。实验前背部剃毛,常规消毒,按0.35mL/kg的水合氯醛进行腹腔内注射麻醉动物。实验分两组,每组20只。各组脊背皮下分别埋置上述两组肌腱（1组为EDC交联，2组为未

4、处理组），3～0丝线缝合伤口,定期换药。分别于术后第1、4周以脱颈法个处死老鼠10只，取大鼠皮下埋藏组织活检,HE染色观察移植大鼠皮下后的免疫反应。观察炎性反应分级[1]I级为试样周围未见或仅见少量淋巴细胞；II级为试样周围可见少量淋巴细胞；III级为试样周围可见少量嗜中性粒细胞、淋巴细胞浸润和巨细胞反应；Ⅳ级为试样周围可见以嗜中性粒细胞浸润为主的炎症反应，可见吞噬细胞。1.4同种异体肌腱移植采用成年兔30只，随机分为两组，分别于双侧跟腱止点处切断[2]。1组为采用未处理的同种异体肌腱进行修复，2组采用超深低温冷冻及EDC交联并肝素化的同种异体肌腱移植进行修复。术后分别于1、3、6个月处死动物

5、，取材作光镜和扫描电镜。1.5统计方法采用SPSS16.0统计软件实现，体内组织相容性实验的统计分析采用χ2检验。2实验结果2.1结果①实验动物全部成活，手术切口均无感染和移植物排出。未交联组埋植于大鼠皮下组织1周，光镜下见肌腱变得疏松，纤维间隙增大，部分纤维变得模糊，基质周围组织水肿，大量炎症细胞浸润,炎症反应分级多为III~Ⅳ级，见图1。②4周时，纤维组织大部分纤维碎裂，降解，正常的纤维排列结构消失，组织水肿消退，炎症细胞浸润减轻，但少量炎症细胞内部浸润，炎症反应分级多为II~III级，见图2。③EDC交联并肝素化组埋于大鼠皮下后，1周取材表现为均质致密结构，周围炎症反应轻微，镜下见炎症细

6、胞浸润，炎症反应分级I~III级，见图3。④4周取材时，结构仍为均质致密的纤维排列，但纤维间有大量的与纤维走行一致的细胞浸润，同时在其周围有大量的新生毛细血管形成。炎症反应分级为I~II级，见图4。⑤对4周取材的标本切片进行α-SMA免疫组化染色，可见EDC交联并肝素化的同种异体肌腱内部不均匀的棕黄色片状染色区域，提示其内部有表达α-SMA的细胞浸润多数为血管内皮细胞，见图5、6。⑥数据表明1、4周EDC交联组炎症反应分级均较未交联组轻，χ2值分别为13.6、14.6，差异有统计学意义（P<0.001）。见表1。2.2同种异体肌腱移植2.2.1组织学观察术后1个月未处理组在肌腱于骨之间可

7、见明显缝隙，存在少量的疏松结缔组织，见图7。实验组肌腱和骨之间出现致密的结缔组织，可见少量排列紊乱的Sharpey’s纤维,但未愈合，见图8。术后3个月未处理组在肌腱与骨之间出现排列无序的Sharpey’s纤维，有疏松结缔组织填充，但部分移植肌腱与骨之间仍有分离，以隧道内口较明显，见图9。实验组肌腱与骨隧道之间出现较多的排列有序的Sharpey’s纤维，并见纤维软骨填充，但无钙化软骨形成，见图10