fas诱导细胞凋亡与糖尿病心肌病变的研究

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1、Fas诱导细胞凋亡与糖尿病心肌病变的研究【摘要】目的：探讨Fas诱导细胞凋亡对糖尿病心肌病变的影响，为进一步研究糖尿病发病机制提供实验依据。方法：按体重将动物随机分为正常对照组(10只)和实验组(20只),各组大鼠禁食12h后,实验组大鼠以60mg/kg的剂量一次性腹腔注射STZ溶液(用0.1mol/L、pH=4.4的构橼酸盐缓冲液在冰浴下配制成11mg/ml的STZ溶液),正常对照组大鼠(NC)注射等体积的枸橼酸盐缓冲液。观察动物饮水、进食及尿量变化等情况。1周后,采尾血测血糖,以血糖浓度>16.6mmol/L,饮水量>40m

2、l/d,尿糖强阳性(+++～++++)的大鼠作为糖尿病大鼠。6周后将各组大鼠处死,切取心室肌组织,进行免疫组织化学实验观察。利用HPIAS2000图像分析系统测定Fas在以上两组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果：糖尿病对照组心肌细胞胞浆内可见极少量棕黄色颗粒，Fas表达弱；实验组心肌细胞胞浆内可见较多棕黄色颗粒，Fas呈强阳性表达。图像分析结果显示对照组与实验组之间Fas的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.05)。结论：糖尿病心肌病变过程中存在心肌细胞凋亡,心肌细胞凋亡可能是导致糖尿病心脏功能障碍的重要原因之

3、一。【关键词】糖尿病;心肌;Fas;大鼠　　糖尿病是威胁人类健康的重大疾病之一，并呈持续增长，对人们的身体健康造成极大威胁。我国2型糖尿病发病率的上升速度远远快于世界水平，预计2010年我国2型糖尿病发病率将达到12%。大量临床资料和流行病调查均显示心血管疾病是糖尿病患者死亡的主要原因。糖尿病心肌病的概念于1974年Hamby［1］等首次提出，经过多年研究之后，学者们证实，糖尿病心肌病系由代谢紊乱触发，引起心肌学改变，从而出现亚临床的心功能异常，而后进展为心肌小血管病变、微循环障碍及心脏自主神经病变，导致心功能不全［2］，是一种独立的疾病。

4、细胞调亡是细胞主动发生的自然死亡过程,是生物体借以拮抗有丝分裂所致的细胞增殖、调节细胞群体数目相对恒定的重要方式。调亡就象秋天枯萎的树叶一样慢慢地、悄无声息地从树干上飘零下来。细胞凋亡不仅是认识细胞死亡过程的基础,而且对胚胎发育、造血、免疫乃至肿瘤的研究都有极为重要的意义。细胞凋亡是细胞内死亡程序活化而导致的细胞自杀过程。凋亡大多发生在生理情况下,某些病理性刺激也可诱导细胞凋亡。Fas又称作APO1，属于肿瘤坏死因子受体（tumornecrosisfactorreceptor,TNFR）和神经生长因子受体（nervegroyeline,S

5、M）途径介导细胞凋亡信号的传导，即Fas被激活后，胞内鞘磷脂酶活化，水解SM产生神经酰胺（ceramide,CM），CM作为第二信使，传递凋亡信号［3］。目前关于糖尿病心肌病变过程中心肌细胞凋亡作用的研究报道甚少。本实验以链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病大鼠模型,观察糖尿病大鼠心肌细胞凋亡,从而揭示心肌细胞凋亡在糖尿病心肌病变发生发展中的作用。　　1材料与方法　　11材料　　111实验动物昆明种SD大鼠30只,雄性,体重180～200g,武汉大学医学院实验动物中心提供,适应饲养1周后进行实验。　　12方法　　121动物模型建立及分

6、组按体重随机分为正常对照组(10只)和实验组(20只),各组大鼠禁食12h后,实验组大鼠以60mg/kg的剂量一次性腹腔注射STZ溶液(用0.1mol/L、pH=4.4的构橼酸盐缓冲液在冰浴下配制成11mg/ml的STZ溶液),正常对照组大鼠(NC)注射等体积的枸橼酸盐缓冲液。观察动物饮水、进食及尿量变化等情况。注射后第2、7d采尾血测血糖,以后每2周测一次血糖、尿糖,将血糖浓度>16.7mmol/L,饮水量>40ml/d,尿糖强阳性(+++～++++)的大鼠定为糖尿病模型。6周后将各组大鼠处死,切取心室肌组织,进行免疫组织化学

7、实验观察。　　122主要试剂浓缩型鼠抗人Fas单克隆抗体（美国SantaCruz公司）；超敏即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒（福州迈新生物有限公司）；显色试盒及多聚赖氨酸（北京中山生物技术有限公司）。　　123主要仪器Y，常规脱蜡至水，蒸馏水洗；②3%过氧化氢37℃孵育10min以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗4×5min；③Fas采用微波抗原修复（3档，10min），PBS洗4×5min；④正常羊血清37℃孵育10min以减少非特异性反应；⑤一抗（Fas，1:100)37℃孵育1h，PBS洗4×5min；⑥生物素标记的二抗

8、，37℃孵育10min，PBS洗4×5min；⑦链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶复合物37℃孵育10min，PBS洗4×5min；⑧DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应；⑨苏木精复