葡萄糖神经酰胺合酶与白血病细胞耐药的关系论文

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1、葡萄糖神经酰胺合酶与白血病细胞耐药的关系论文谢平，葛素梅，沈云峰，顾中华，穆会君，张滨【摘要】本研究旨在观察葡萄糖神经酰胺合酶（glucosylceramidesynthase,GCS）基因及其蛋白在人白血病细胞的表达及其与肿瘤多药耐药的关系。首先以β-actin基因为内参照物，采用RT-PCR方法分析了53例耐药/非耐药白血病患者外周血标本，并对药物敏感的HL-60细胞株和对阿霉素耐药的HL-60/ADR细胞株中GCS基因的表达水平进行检测.freeldr1）的表达进行比较。继而采用ultidrugResistanceinLeu

2、kemiaCellsAbstractThisstudyidesynthase(GCS)inhumanleukemiacellsanditsrelationshipultidrugresistance.RT-PCRplesfrom53leukemiapatientsultidrugresistance/non-resistance,andtodetecttheexpressionlevelofGCSgeneinHL-60cellsandHL-60/ADRcells,theexpressionleveldr-1.Theexpressi

3、onsofGCSproteinandP-gpproleininHL-60cellsandHL-60/ADRcellsplifiedbandsinsamplesofleukemiapatientsplesofleukemiapatientseanentofopticaldensityvalueofGCSgeneamplifiedbandsacpamiedbyhighexpressionofmdr-1gene.TheircorrelationshoRNAandproteineandr-1mRNAandP-gpalsosignifica

4、nflyincreasedinHL-60/ADRcells.ItisconcludedthatthehighlevelofGCSinleukemiapatientspossiblyisassociatedultidrugresistanceofleukemiacells.Keyidesysthase;multidrugresistance;leukemia;RT-PCR;DR）导致的化疗失败则是白血病治疗中困扰临床的重大难题。目前国内对MDR的研究较集中在药物转运泵的作用致药物外排增加从而产生耐药。为了进一步探讨白血病耐药的相关机

5、制及寻找逆转白血病细胞耐药的靶标，我们将从另一条新的途径即神经酰胺信号系统中葡萄糖神经酰胺合酶（glucosylceramidesynthase,GCS）的表达水平对白血病细胞耐药作用进行研究。材料和方法临床标本53例白血病患者标本全部来自无锡市第一人民医院，其中男31例，女22例，年龄18-82岁。经临床、细胞形态学、免疫学等项检查，符合全国统一的白血病诊断标准。治疗缓解标准按照1987年全国白血病防治研究协作会议拟订的白血病疗效标准规定，未达到缓解标准为耐药。在53例中耐药27例，非耐药26例。细胞株包括人类白血病细胞株HL-

6、60及阿霉素耐药株HL-60/ADR。细胞培养将细胞维持在含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI1640培养液里，并置于37℃，5％CO2的培养箱中进行细胞培养和传代。RT-PCRmRNA分析RNA抽提采用TRIzoL提取法抽提外周血标本的单核细胞及培养细胞的总RNA，并通过检测其在A260和A280处的吸光度，计算RNA含量及纯度。引物设计利用计算机软件primerpremier5.0辅助设计3对引物，经BLAST比对确认其特异性后由上海生工生物公司合成，其核苷酸序列见表1。Table1.Oli

7、gonucleotidesequencesofprimersforGCS,mdr1andβ-actin（略）RT-PCR扩增使用随机引物对GCS、mdr1及β-actin基因的mRNA进行逆转录反应。PCR扩增条件为：94℃5分钟,94℃60秒,55℃45秒,.freelmol/L的冷TNT溶液（20mmol/LTris-HCl,pH7.4,200mmol/LNaCl,1.0%TritonX-100,1.0%mmol/LPMSF,1.0%抑蛋白酶肽）裂解细胞，60分钟后经12000×g离心15分钟以去除未溶解的细胞碎片，并收集上清

8、液测定其蛋白浓度。SDS-聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳取150μg总蛋白上样进行SDS-PAGE（Invitrogen公司产品），于125V恒压电泳90分钟以分离蛋白质样品。蛋白质电转移及免疫学检测经25V，2小时电转移后，用封闭试剂（3％去脂奶