大鼠脊髓腰节段神经元存活信号转导通路及凋亡调控因子的增龄变化

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1、大鼠脊髓腰节段神经元存活信号转导通路及凋亡调控因子的增龄变化作者：李雅莉赵宁张丽李林【摘要】目的观察大鼠脊髓腰节段神经元存活信号转导通路中重要因子和调控凋亡相关因子的增龄变化及与老化的关系。方法按月龄将雄性SD大鼠分为1、3、6、12、18、24月龄6组。应用免疫组织化学染色和ED、二甲基甲酰胺、预染标准分子量蛋白质，购自美国GibcoBRL公司；浓缩显影液、浓缩定影液购自乐凯公司。　　1.3主要仪器　　620E型冷冻切片机（英国Shandon公司）；CHK213型光学显微镜、BX51型生物显微镜（日本Olympus公司）；ImageproP

2、lus4.0图像分析系统（美国）；Po。每只大鼠各取位置相同的3张脊髓片，用3%H2O2室温孵育10min；磷酸盐缓冲液（PBS）洗5min，洗3次；10%羊血清室温封闭30min，PBS洗5min，洗3次；分别加入不同的一抗（PI3K抗体、pp70S6K抗体、Bax抗体）孵育，PBS洗5min，洗3次；加入生物素标记的兔二抗，室温孵育2h，PBS洗5min，洗3次；加入HRP标记的三抗，孵育1h，PBS洗5min，洗3次；DAB工作液显色，显微镜下控制染色程度；梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，置于显微镜下观察。阴性对照：分别以PBST

3、和非免疫正常血清代替一抗进行免疫组化染色，其余步骤同前。　　1.4.3in，取上清液。用Folin酚法测定蛋白浓度，调节各样品蛋白浓度统一为5g/L，加2×上样缓冲液，100℃沸水浴变性5min。分离胶为15%SDSPAGE凝胶，电泳缓冲液为Tris甘氨酸，上样量50μg/孔。恒压60V电泳至溴酚兰到达分离胶后，加大电压至120V，溴酚兰到达分离胶底部时，结束电泳。冰浴中90V转膜120min，将凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜。5％脱脂奶粉封闭，4℃过夜。分别加入不同的一抗（PI3K抗体、pCREB抗体、Bax抗体、Bcl2抗体、βac

4、tin抗体），室温2h；加入HRP标记的二抗，室温1h；ECL法显示特异条带。用扫描仪将胶片的图像转入计算机中。使用ImageJ凝胶成像分析系统，对各个条带的整合灰度进行分析。将胶片上的6月龄组（青年组）所对应条带的整合灰度值设定为100％，计算出其他各组对应条带的整合灰度值与6月龄组的相对百分比。　　1.5统计学分析　　使用SPSS11.5软件进行单因素方差分析（One.　　2.1.2cl1等。Bcl2基因是调节细胞凋亡最基本的成员，被认为是能特异地抑制凋亡发生的“抗凋亡基因”。提高Bcl2的表达水平，不仅可以保护神经元对抗不同的损伤因

5、素，而且能促使哺乳动物神经系统轴突再生。Bcl2调节着神经营养因子依赖的神经元存活〔8〕，破坏Bcl2将导致神经元致死性的损伤〔9〕。神经元内Bcl和Bax的比例与神经元的存活与否有关,比例高则神经元趋于存活,反之则趋于凋亡。尽管细胞内Bcl2/Bax的比例固定，但外界刺激可以改变抑制凋亡的Bcl2Bax与促进凋亡的BaxBax的量发生改变。Bcl2和Bax可通过形成同源或异源二聚体来调节细胞凋亡。随着Bcl2表达增多，BaxBax分开，形成Bcl2Bax异源二聚体，中和了BaxBax促进凋亡作用。脊髓的Bax免疫反应阳性

6、细胞集中于Ⅱ板层。而这些细胞所接受的前一站神经元如脊神经节、三叉神经节等也表达Bax蛋白〔10〕。本研究观察到促凋亡因子Bax在大鼠脊髓腰节段的表达随增龄而增加，老年期（24月龄）Bax的表达与青年期（6月龄）相比显著增多，而抑制凋亡因子Bcl2在老年期的表达与青年期相比显著减少，推测可能是由于老年期神经营养因子和神经元存活通路中相关因子的表达降低，导致Bax表达升高，Bcl2表达降低，其结果可能引起老年期脊髓神经细胞凋亡增多。本研究对1、3、6、12、18、24月龄大鼠脊髓腰节段的神经元存活通路相关因子和调控凋亡相关因子进行了观察，发现大鼠

7、脊髓的神经元存活通路相关因子pp70S6K、pCREB和调控凋亡相关因子Bax、Bcl2均存在着随增龄的变化，提示上述因子有可能作为脊髓老化和脊髓损伤的检测指标，并可为进一步开发抗脊髓老化和脊髓损伤药物提供新的靶点。【参考