人类乳头瘤病毒hpv58亚型l1重组蛋白原核表达与鉴定

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1、人类乳头瘤病毒HPV58亚型L1重组蛋白原核表达与鉴定1文献综述1.1病原学1907年Giuffo发现皮肤疣的病是乳头瘤病毒引起的，随着人们对乳头瘤病毒的认识，在人以及许多动物中也相继发现了乳头瘤病毒,被广泛研究的人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)逐渐开始被认知，1933年Shope从棉尾兔和野兔（cottontailrabbitand[11]。多年以来经过大量深入的研究，人们已经对HPV非常了解，HPV是一种最小的DNA病毒，该病毒直径约为50-60nm，呈无包膜的20面体对称的核衣壳结构，表面有72个壳微粒，内含8000个碱基对

2、，分子量为5000KD。HPV的结构中,把早期转录区称为E区，主要编码E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8这8个早期类蛋白。E1的功能与的HPV的DNA的复制密切相关；E2是一类激活蛋白；目前E3蛋白的功能尚不清；E5蛋白与细胞的转化关系紧密，早期基因E6和E7是HPV编码的主要癌基因[13,14]。晚期转录区又被称为L区，由2500对碱基，主要编码2个衣壳蛋白即L1蛋白和L2，L1是主要衣壳粒蛋白，L2是非主要衣壳粒蛋白，构成HPV的衣壳，还和HPV的增殖有关联[15,16]。非转录区又称为上游调节区或非编码区，由1000对碱基，在E8和L1之间。

3、衣壳蛋白L1是一种糖蛋白，当翻译并经过加工之后在较短的时间之内即会定位于核中。该蛋白包含有大约五百多个氨基酸残基，L1蛋白上富含糖基化的相关位点，可能对其折叠有作用。在病毒颗粒形成过程中，L1蛋白具有自我组装的功能。HPV的衣壳蛋白具有高保守性的特点，不易发生变异，而别的病毒衣壳粒则不具有该特性[18,19,20]，这一点也成为对其研究的重点，也成为攻克该病毒所引起的疾病的的切入点，这种保守性主要体现在两个方面，一是该病毒的衣壳的变异性很小，几乎不变；另一方面是不同亚型的HPV的同源性达到60％以上[21]。2HPV58L1蛋白的表达HPV的主要衣壳粒蛋白L1

4、与病毒颗粒一样，低剂量即可引起高效的免疫反应，L1蛋白在免疫后能诱导针对病毒表面多个中和表位的抗体反应，对于HPV病毒的保护性抗体主要为构象抗体，有活性的L1蛋白能在体外自发的形成病毒样颗粒，VLP作为一类理想的亚单位疫苗，形成了病毒的天然构象。本实验通过诱导pGEX-6p-1-HPV58-L1表达，通过超声破碎裂解表达菌体，由于目的蛋白主要以包涵体的形式出现，用8M尿素溶解进行梯度复性法，复性获取HPV58-L1蛋白，并进行生物学鉴定。2.1材料与方法2.1.1菌株及载体重组质粒pGEX-6P-1-HPV58-L1由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室构建。

5、2.1.2酶及主要试剂质粒小提取试剂盒购自美国Axygen公司，IPTG、HRP标记IgG购自华美公司；AEC酶底物试剂盒购自中山金桥；JM109感受态和BL21感受态细胞购自百奥莱博科技公司。2.2方法2.2.1重组融合蛋白HPV-58L1的诱导表达将正确构建的pGEX-6P-1-HPV58-L1重组质粒转化到E.coliBL21(DE3)表达宿主细菌中，挑取单菌落接种于LB-Amp+培养基中培养过夜，按1:100比例转到100ml含有Amp+抗生素的LB培养基中，加入IPTG（终浓度为0.6mM）37℃诱导表达过夜，进行SDS-PAGE电泳鉴定；高速离心机

6、4℃，15min，10000r/min离心收集菌体，用10ml的PBS（预冷）重悬冰上放置30min，冰上超声波破菌，30%全功率，5s工作，5s间隔，持续20min，高速离心机4℃12000r/min离心20min，取1ml超声破碎的菌液，进行12000r/min离心鉴定，取上清沉淀分别进行SDS-PAGE电泳。.3分子伴侣促进HPV58L1蛋白可溶性蛋白表达.203.1实验材料与方法.........203.1.1菌株与载体.........203.1.2酶与主要试剂.......203.1.3主要是剂药品的配置........203.1.4主要仪器...

7、.203.2实验方法........213.3实验结果........253.4讨论.....303.4.1分子伴侣对目的蛋白可溶性表达的作用......303.4.2伴侣分子对蛋白活性的作用及纯化的问题....313.4.3伴侣分子对蛋白活性的作用及纯化的问题....31讨论生物工程下有技术中其中的重要技术之一就是对无活性的包涵体进行复性。除了在体外利用各种技术方法研究提高包涵体复性率外，现在已经构建出了许多新的表达载体系统，用以降低蛋白质在表达过程中形式包涵体的几率[69,70]，并促进形成具有天然三维结构的蛋白质。常用的这些方法有：1）克隆的外源蛋白质与

8、分子伴侣（molecularchape