黄芪多糖对糖尿病大鼠肾组织胰岛素受体及其底物1的影响

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1、黄芪多糖对糖尿病大鼠肾组织胰岛素受体及其底物1的影响【关键词】黄芪多糖糖尿病肾病胰岛素受体胰岛素受体底物1糖尿病肾病(diabeticnephropathy，DN)发病机制尚未完全阐明，已有研究证实直接或间接与高血糖有关，糖尿病状态下机体糖代谢严重障碍。胰岛素（insulin，Ins）是调节糖代谢最主要的激素，其生物效应由其靶细胞膜上胰岛素受体(insulinreceptor,IR）介导，胰岛素受体底物-1（insulinreceptorsubstrate-1,IRS1）是IR下游第一个底物分子，在其信号传导

2、途径中起着极其重要的作用，已有的研究表明糖尿病状况下肾脏组织细胞膜胰岛素受体的数目和亲和力均存在异常［1，2］。本研究运用黄芪多糖（APS）治疗高脂饮食喂养加小剂量链脲佐菌素（STZ）注射诱导糖尿病（DiabetesMellitus，DM），拟进一步观察APS对糖尿病状态下肾脏组织IR与IRS1蛋白表达的影响，探讨其影响机制。　　1材料与方法　　1.1材料健康清洁级雄性SD大鼠40只，体重180～200g，由武汉大学实验动物中心提供。STZ，美国Sigma公司。APS溶液：APS从山西产黄芪根中提取制成粉剂，临

3、用前用生理盐水新鲜配制成20g/L的溶液。鼠IRS－1单克隆抗体，美国Neomarkers公司。兔InsR多克隆抗体，武汉博士德生物工程有限公司。SP试剂盒，北京中山生物技术公司。OnetouchⅡ血糖测定仪及试纸，美国JansonandJanson公司。切片机，国产LKB11800。显微镜，日本OlympasCH30。HPIAS1000型全自动图像分析系统。　　1.2方法　　1.2.1糖尿病模型的建立与分组　　实验动物分为4组。正常对照组：给予普通饲料（60%碳水化合物，22%蛋白质，10%豆油脂肪，包括

4、纤维素在内的其他成分8%）喂养，用等体积生理盐水灌胃处理5周。APS对照组：普通饲料，APS溶液［400mg/（kg·d）］灌胃处理5周。DM组：给予高脂饲料（41%脂肪，41%碳水化合物和18%蛋白质），尾静脉注射链脲佐菌素（STZ）（30mg/kgSTZ，溶于0.1mol/L柠檬酸缓冲盐溶液，pH4.5），注射后动物自由进食，进水并维持高脂饮食，STZ注射72h后，测动物空腹血糖，大于6.7mmol/L者可诊断为糖尿病［3］。DM+APS组：空腹血糖大于6.7mmol/L的动物继续喂以高脂饲料，同时APS溶液

5、［400mg/（kg·d）］灌胃处理5周。　　1.2.2各项指标检测　　所有大鼠观察毛发、活动等情况，并取尾静脉血测空腹血糖。　　1.2.3IR与IRS-1蛋白的检测　　处死动物后，取肾组织，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片（4μm）；3%H2O2室温孵育10min；5%～10%正常山羊血清封闭10min；加入一抗，37℃孵育1～2h；滴加生物素标记的二抗，37℃10min；滴加辣根过氧化物酶标记的链卵白素，37℃10min；DAB显色，室温3min；苏木素复染1min；酒精脱水；中性树胶封片。免疫组化图像分

6、析应用高清晰彩色病理图像免疫组化测量系统（HPIAS1000），经标准灰度校正后，随机取5个视野，分别测定IR，IRS-1的平均光密度值（IDP）。　　1.2.4统计学处理　　采用SPSS11.5统计软件进行，实验数据以均数±标准差(±s)表示,组间比较用t检验。P<0.01有显著性差异。　　2结果　　2.1实验动物一般情况　　DM大鼠毛发干枯、杂乱、脱落、蜷卧、活动减少。给APS治疗后，大鼠精神好转、毛发光整、有色泽、活动增多。　　2.2血糖如表所示，DM组和DM+APS组血糖水平均高于对照组，差别有显

7、著性（P<0.01），DM+APS组血糖水平低于DM组，差别有显著性（P<0.01）。胰岛素经血液循环到达相应靶组织后，与其上的胰岛素受体α亚单位相结合，激活其β亚单位的内在激酶活性，导致IR自磷酸化。磷酸化的IR一方面为其它信号分子提供结合位点，另一方面其磷酸激酶可致IRS－1磷酸化。IRS－1被磷酸化后即暴露出特异性结合位点，能募集并激活含有SH2区域的蛋白质激酶磷脂酰肌醇3激酶（PI3K），使信号以激酶链式反应下传。IRS－1通过激活PI3K激酶导致磷酸肌醇依赖的蛋白激酶（PDK1）的激活，后者

8、可使蛋白激酶B（PKB）磷酸化，活化的PDK1或磷酸化的PKB可导致葡萄糖转移因子4（GLUT4）的合成、分泌、移位等变化［4，5］。GLUT4是直接影响葡萄糖入胞的细胞因子，对血糖的调节极其重要。现有资料表明，血糖的调节主要受IR/IRS－1/PI3K/PDK1/PKB/GLUT4信号途径的影响，所以当其信号径路中IR和IRS发生障碍或异常时可导致糖尿病［4，5］。本实