葡萄籽提取物对缺血再灌注导致衰老大鼠肾小管上皮细胞凋亡的保护作用论文

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1、葡萄籽提取物对缺血再灌注导致衰老大鼠肾小管上皮细胞凋亡的保护作用论文洪权肖博晗魏日胞汪杨刘晓峦冯哲陈香美【摘要】目的探讨葡萄籽提取物（Grapeseedextractproanthocyanidin，GSPE）对缺血再灌注（I/R）导致衰老大鼠肾小管上皮细胞凋亡的保护作用。方法分离培养24月龄DA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性。激光共聚焦检测细胞内活性氧(ROS)的浓度。结果（1）衰老大鼠肾小管细胞经AntimycinA处理后，凋亡率增高.freeliaandreperfusion.MethodsTh

2、e24monthDAandROSulationofROSandthedamageofmitochondrialeadtotheapoptosisofrenaltubularepithelialcell.GSPEcanremoveROSandpreventtheapoptosisofkidneytubularepithelialcells,lessentheimpairedeffectsofI/R.【Keyia/reperfusion;Apoptosis急性肾脏缺血再灌注(I/R)损伤是休克、严重创伤及肾移植

3、过程中一种常见的临床病理生理现象，可以导致急性肾衰竭（ARF）和移植肾功能丧失，在这一过程中最先受到损伤的细胞是肾小管上皮细胞，老年人由于容易出现肾脏低灌注状态，如心肌梗死、脱水、利尿剂的使用以及老年人常见的肾动脉硬化因此更容易出现ARF。近年来ARF中活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）激增导致的肾小管上皮细胞凋亡引起了人们的关注〔1〕。很多的证据显示ROS能增加线粒体通透性转变孔道（PTP）的通透性，导致细胞色素C释放，引起凋亡。既往研究认为葡萄籽提取物(GSPE)具有抗氧化功能

4、，可减少动脉硬化，能影响内皮细胞的凋亡增殖过程。本研究模拟并观察老年大鼠肾小管上皮细胞在缺血再灌注（I/R）损伤情况下，ROS在肾小管上皮细胞凋亡中起到的作用。使用抗氧化剂葡萄籽提取物（GSPE）给与实验性治疗，观察GSPE抑制ROS产生后，是否对肾小管上皮细胞有保护作用及对老年高ROS负荷状态的治疗效果。1材料与方法1.1实验动物与器材雄性EM培养基、Trizol试剂、MMLV反转录试剂盒（美国Invitrogen公司），AntimycinA（抗霉素A，AA），AnnexinV/PI凋亡检测试剂盒（美国

5、Biodesign公司），兔来源抗caspase3多克隆抗体（美国SantaCruze公司），CaspACETMAssaySystem（Promega公司）、IcyclerPCR仪、radiance2000激光共聚焦显微镜（美国Biorad公司）。1.2方法1.2.1细胞培养常规方法分离大鼠肾小管上皮细胞，用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养液，常规条件下培养。细胞以适当密度转种，实验前换用含0.5%FBS的DMEM培养液继续培养。1.2.2实验分组肾小管上皮细胞加入5.0μmol/LGSPE和/

6、或10μmol/LantimycinA的10%FBSDMEM孵育2h，37℃预温的PBS清洗之后换成正常的培养液，以模拟细胞缺血再灌注损伤状态。实验分为正常对照组，AntimycinA组，GSPE组和AntimycinA+GSPE组。1.2.3细胞凋亡检测分析AnexinV/PI染色：胰酶消化细胞，PBS清洗2次，加入适量的荧光标记的annexinV试剂和PI，混匀后避光室温下孵育15min，孵育后加入400μl染色缓冲液，立即上流式细胞仪分析并记录结果。1.2.4激光共聚焦检测细胞内ROS含量直径3mm激

7、光共聚焦专用培养皿中肾小管上皮细胞经GSPE和/或AA处理后，加入10μmol/LCMH2DCFDA37℃孵育15min，随后PBS清洗2次，于激光共聚焦显微镜下检测观察，激发波长选用485nm，发射波长选用530nm。利用LaserPixImagesoftePCR检测caspase3mRNA表达Trizol提取各组细胞总RNA，逆转录为cDNA。设计合成大鼠capase3引物，上游：5′AATTCAAGGGACGGGTCATG3′，下游：5′GCTTGTGCGCGTACAGTTTC3′，Ta

8、qman探针：5′FAMTTCATCCAGTCACTTTGCGCCATGTAMRA3′，产物长度：96bp。25μlPCR体系中含：1.0μlcDNA,.freelmol/LMgCl2,1μldNTPMix，0.25μlDNA引物，2.5μl10×PCRbuffer，1.5UTaqDNA聚合酶，PCR扩增反应条件为：94℃/30s，56℃/30s，72℃/30s，共40个循环。以大鼠GAPDH为参照，上游