高效桔青霉纤维素分解菌筛选及酶学初探

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1、·东北农业大学硕士学位论文高效桔青霉纤维素分解菌筛选及酶学初探姓名：曲小爽申请学位级别：硕士专业：微生物学指导教师：许修宏20090620···摘要摘要本研究利用采自云南的某土壤样品，分离获得了一株高效纤维素分解菌株。根据其形态学特征、生理生化特性及遗传分析初步鉴定该菌株为桔青霉（Penicilliumcitrinum），命名为CR-2菌株。研究了该菌株液体发酵产纤维素酶条件及特征，并对该菌株所产纤维素酶组分进行了部分分离纯化，对纯化得到的内切葡聚糖酶的酶学特性进行了分析研究。本研究将为桔青霉纤维素酶纤维素降解机制研究及新酶分子构

2、建等提供重要理论依据。研究结果具体如下：1.CR-2菌株在纤维素平板上倒置恒温28℃培养3天有淡绿色菌落出现，在刚果红染色、NaCl脱色后可以观察到菌落周围有明显透明水解圈出现。利用划线法纯化以后，接种到PDA培养基上观察菌落：该菌株起初菌落白色，后变为灰绿色，茸毯状，菌落背面微黄色。菌丝无色，0.8～1.4µm宽。分生孢子梗短，柱状，上部有分支，一般长5～15µm，宽1.0～1.5µm；分生孢子梗下部不分支，瓶梗多3～5个生于分生孢子梗顶端，密集，3.1～7.1×1.6～2.8µm，烧瓶状，近基部最宽，顶部宽0.5～1.2µm；

3、分生孢子近圆形，分散。并通过对CR-2菌株的核糖体-DNAITS序列同源性比对分析，鉴定该菌株为桔青霉（Penicilliumcitrinum）。2.将CR-2菌株分别接种到不同碳、氮源的产纤维素酶培养基中，通过比较分析研究，确定了较优产酶培养条件为以玉米秸秆粉作为碳源，摇床转速为200rpm，培养温度为30℃，初始pH6.5，连续培养7天。CR-2在该条件下羧甲基纤维素酶活最高可以达到49.91IU/ml，滤纸酶活力最高可以达到26.9IU/ml，β-葡萄糖苷酶活力为最高可以达到0.12IU/ml。3.利用盐析、分子筛、离子交换

4、技术、超滤技术等蛋白分离纯化方法，从CR-2菌株的发酵粗酶液中分离纯化得到了内切葡聚糖酶蛋白。初步分析表明该内切葡聚糖酶分子量为27.26kDa。4.酶学特性研究表明，该内切葡聚糖酶的最适作用温度是70℃左右，最适作用pH是4 左右；该酶在20℃～70℃和pH3～pH6之间有较高的稳定性，Na+、K+离子对内切葡聚糖酶 有促进作用，Cu2+、Mn2+、Ag+离子对内切葡聚糖酶有抑制作用，其它离子对该酶的活力影响不大。该内切葡聚糖酶动力学分析表明其Vmax=2.88mg/min·ml，Km=0.046mg/ml。关键词：纤维素降解菌

5、筛选；桔青霉；发酵产酶条件；酶部分纯化；酶学特性···I···东北农业大学硕士学位论文ISOLATIONOfHIGHEFFICIENCYCELLULOSE-DEGRADINGPENICILLIUMCITRINUMANDITSENZYMOLOGYCHARACTERISTICSAbstractAnewstrainofhighefficiencycellulose-degradingisisolatedfromsoilofYunNanprovince. Morphologicalandphysiologicalpropertiesoft

6、hisstrainhavebeenstudied.Accordingtothese results,thisstrainwasidentifiedasPenicilliumcitrinum,namedCR-2..Themediumcomponentsof theoptimalliquidstatefermentationofCR-2,thepurificationofendoglucanasefromCR-2and characteristicsofthepurifiedendoglucanasearestudied.Theres

7、ultsareillustratedasfollows:1.CR-2strainiscultivatedbycelluloseplateinverselyatconstanttemperature28℃,after 3dayscultivation,thegreenandgraycoloniesappeared.AfterdyingbyCongoRedsolutionand decoloringbyNaClsolution,thetransparenthydrolysiscircleappeared.Toseethecharact

8、erization ofthecolonies,themyceliaandconidia,strainisinoculatedonthePDAmediumafterisolation.The coloniesarewhiteatfirstthent