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《质粒构建详细方法步骤》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、一，引物设计：1，选择合适的裁体。酶切位点及其顺序(酶切位点的顺序一定不能颠倒)。2,在NCBI上再次确认0的片段的碱基序列。1，2,3,4,Primer一down核对~~送公司合成使川word排除目的R段里含有的酶切位点，最后确定所使用的酶,设计引物：primer-up：对公司合成的引物离心，lOOOOrpm、5-10分钟、at4°C,在超浄台按照管子上标注的体积加入高压水(2dH20),再把上游引物和下游引物混在一起，at4°C保存。，PCR(P出目的片段)：1,揺菌过夜:，韩家淮实验室的菌液，3由的抗生素一)、
2、从韩家淮实验室赠送的菌液里P出目的片段：2,per:2xPFUmixPrimerlu2dH2023ul'1B2°C)3，跑胶、回收:(1)，配胶：25ulOsec33cycles94°C5min94°C30sec直来计算，一般低于Tm值1%的琼脂糖胶：人块0.6g的琼脂糖、入60ml的IXTAE煮沸3次.0.6ul的EB(待温度降到5O-6()C左右吋)W点样跑胶。电长度设定，500-1OOObp/min,退火温度根据Tm2b分钟;H，(2),跑胶:130-150Vs25-30分钟左右。(3)，紫外灯下观察，切胶(要
3、带防护手套和口罩)4,做胶冋收(天根｛TIANGEN｝公司的DNA纯化回收试剂盒)：按照试剂盒的protocol來做，在胶冋收的最后一步，ElutionBuffer预先在55-65°C温箱屮水浴，并且在加过EB后，放在37°C温箱屮2min。对胶回收的产物跑胶验证。可建立10ul的体系：回收产物2ul、1Oxloadingbuffer2ul>2dH206ub三，酶切、链接：1,目的片段酶切：(37°C酶切过夜或者4小时)50ul的体系insert:上述胶回收产物35ul10xHbuffer(1.5x)7ul11206
4、ullul2lul2,载体酶切：(37^酶切过夜或者4小吋)20ul的体系Vector(lug/ul)：2ul10xbuffer(1.5x)3ul,H2013ul西司1lul酶2lul为方便以后使用，fe体可以一次性多切点。3，酶切时，首先要核对一卜*酶的buffer,荷时双酶切时W个酶不能共用一种buffer,那么就要先切一端，酶切冋收后再用另一酶切另一端，然后再酶切产物回收。4，连接：6ul'2xRapidLigationVe:tor0.8ul12ul的体系insert4.5ul（目的是为了多加点insert）T
5、4DNALignaselul感受态细菌10ul四，转化：L⑴、⑵、⑶、质粒1Oul、90秒-一冰上2分钟37°C、180rpm、45分钟。m乂口口u岡又/jji八j:100ml的LB中。再按抗生素：LB=l:1000的比例加入抗生素，（100ml的LB加50ul的2Kx的氨苄）。⑷、250rpm、过夜。五，质粒大抽：六，收菌：取过夜菌至50毫升离心管，离心:6000g、3-5分钟、4'C。再重复一次，每管共收集100毫升过夜菌沉淀。（倒置于草纸上使液体流尽）。七，重悬：每管加入8ml的RES-EF（RnaseA）,重
6、悬细菌沉淀一充分Vortex或用枪头吹打沉淀。确保沉淀完全散开，无可见细菌团诀。3，裂解：每管加入等量的LYS-EFbufffer,即8ml。轻轻上下颠倒离心管4_6次，（勿震！！）室温放置^in，使细菌完全裂解，溶液透明，无团块或絮状物。注意：vortex或其它剧烈操作会导致基因组DNA断裂，易导致最终所得质粒被基因组DNA污染4，平衡：（1）：滤芯插入柱子，将柱子驾于50ml离心管上（或者直接架于50ml离心管架上）⑵：取15mlEQU-EFbuffer沿滤芯叫周加入一充分平衡滤芯。注意：①离心管内的液体不要浸没
7、滤柱的头，所以要勤于倒弃滤液，②在过滤平衡液的同时，进行5、6步，防止滤芯干掉。4,中和：在等待EQU-EFbuffer滤完时，往裂解好的菌液中加入8mlNEU-EFbuffer,颠倒混匀，冰上孵育5min。（不能vortex）5,离心、过滤：（1）：离心中和过的菌液:lOOOOrpm、5-lOmin、at4°C~质粒存在于上清中。（离心使沉淀更加紧密，更集中于管底，对于进一步提高质粒质S会有所帮助）（2）：将上清吸入到平衡好的滤芯中，重力自流尽。7，洗一：过滤完毕后，吸取5ml的EIL-REbuffer,沿滤芯四周
8、加入（将粘在滤芯上的质粒洗下來）~过滤完后，将滤芯弃掉。8,洗二：往滤柱中加入35ml的ENDO-EFbuffer—去内毒素9，洗三：待滤完后再加入15ml的wash-EFbuffer—过滤。10,洗脱：取一支干净的15ml超速离心管，将滤完的柱子插入到离心管中，用高压条将二者绑好，往滤柱中加入5mlElu-EFbuffer.（Elu-REbu
