质粒抽提原理和详细操作步骤

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1、质粒抽提,实验室必备技能之一质粒质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。质粒抽提从细菌中分离质粒DNA的方法包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用强碱液、加热或溶菌酶（主要针对革兰氏阳性细菌）可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）和TritonX-100（一般很少使用）可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS或TritonX-100处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切

2、断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA(Covalentlyclosedcircular　DNA，简称cccDNA）的两条链不会相互分开。当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。质粒抽提最常用的方法是碱裂解法，它具有得率高、适用面广、快速和纯度高等特点。当然，碱裂解法也有缺陷：容易导致不可逆的变性。要降低不可逆的变性，就要控制好碱裂解的时间。碱裂解

3、法抽提质粒需要用到以下三种溶液溶液Ⅰ50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-Cl（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0），在15psi压力下蒸汽灭菌15min，4℃保存。溶液Ⅱ  0.2mmol/LNaOH（从10mmol/L贮存液中现用现稀释），10g/LSDS（室温保存）。溶液Ⅲ5mol/L乙酸钾60.0mL，冰乙酸11.5mL，无菌水28.5mL， 4℃保存，使用时置于冰浴中。  下面介绍一下碱裂解法小提质粒的具体操作：01柱平衡：向吸附柱中加入500μl平衡Buffer，12000rpm离心30-60s

4、，倒掉收集管中的废液；注意：吸附柱平衡后可最大限度激活硅基质膜，提高质粒的得率；吸附柱平衡后应立即使用，长时间放置会影响其吸附效果。02收菌：将过夜培养的菌液用8000g，2-3min低温离心，吸弃液体培养基；注意：高拷贝的质粒，需要5-15mL的培养菌液；低拷贝的质粒，则需要15-30mL的培养菌液；残留的液体培养基过多会影响细菌的裂解效果，应尽可能吸干培养基。03向离心管中加入250μl溶液Ⅰ（加入RNaseA），吹匀菌沉淀并将悬液转移至新1.5mLEP管中；注意：菌体悬浮不完全会导致裂解不完全，质粒提取量和纯度会降低。04向EP

5、管中加入250μl溶液Ⅱ（裂解Buffer），温和翻转EP管6-10次，使菌体充分裂解，液体变得澄清浓稠（开盖拉丝）；注意：所用时间不宜超过5min，以免质粒被破坏；切勿剧烈震荡；液体未变得澄清，则表明裂解不充分，可适当减少菌体量或增大Buffer使用量；若溶液Ⅱ出现浑浊，可37℃水浴几分钟，待液体恢复澄清即可使用。05向EP管中加入350μl溶液Ⅲ，温和翻转EP管6-10次，此时可观察到管内出现白色絮状沉淀，12000rpm室温离心10min；注意：若上清中仍有少量白色絮状物，可再次离心2-3min直至液体澄清。06将离心后上清转移

6、至吸附柱中，12000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液；07可选：向吸附柱中加入500μlBufferPD（富含蛋白酶），12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；注意：此步对富含内源核酸酶的宿主菌（endA+）是必须的，对于endA-宿主菌可省略。08向吸附柱中加入600μlWashBuffer（加入无水乙醇），12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；09重复步骤8一次；10将吸附柱和收集管放回离心机中，12000rpm空转离心2min；注意：此步骤非常关键，乙醇是否去除干净会影响后续的洗脱效率以及PCR

7、等效果。11将吸附柱转移至新的1.5mLEP管中，拿到超净工作台中开盖鼓风吹5-10min；12向吸附柱膜的中央滴加40-50μl预热ElutionBuffer或者DD水，关盖静置3-5min，12000rpm离心2min；注意：洗脱Buffer预热后效果更好；可以根据质粒的拷贝数、宿主菌等因素调整洗脱Buffer的添加量。13离心后将EP管内的液体重新滴加至吸附柱膜上，12000rpm离心1min；14做好标记，取2μl质粒跑1%琼脂糖凝胶电泳检测验证；15提取出的质粒-20℃保存。抽提质粒中的常见问题1 提不出质粒或者质粒提取量很

8、少(1) 菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如柯斯质粒在大肠杆菌中保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。(2)