【5A版】质粒抽提.ppt

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1、质粒DNA制备plasmidextraction质粒简介质粒(plasmid)是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状DNA分子其大小范围从lkb至200kb以上不等。已经在形形色色的细菌类群中发现质粒.这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。ChromosomeDNAgenomePlasmidDNA质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值，而质粒的分离与提取则是最常用、最基本的实验技术．质粒特性1.分子相对小2.含有高效的自主复制成分3.不相容性(incompatibility)4.

2、转移性5.选择的标记(selectivemarkers)6.限制性内切酶单一切口质粒的结构特点分子量相对较小共价闭合分子双链环状结构具有更强的抗切割和抗变性能力超螺旋DNA分子线性DNA分子半开环DNA分子Plasmidvectors表达载体载体含有tac启动子、Lac操纵基因、SD序列、LacI阻遏蛋白基因等Exprssionvector细菌收集纯化质粒DNA细菌培养细菌裂解质粒DNA的提取和纯化质粒DNA的提取和纯化一、细菌的培养(bacterialculture)l先分离单个菌落，接种到含少量适当抗生素的培养基中扩增，随着细菌的生长，质粒DNA也在自主复制。

3、对于松弛型质粒，由于它的复制在一定程度上不受到宿主细胞的控制，故在细菌对数生长后期，加入氯霉素（chloromycetin）抑制宿主蛋白质的合成和染色体DNA的复制。质粒DNA的复制不受影响而大量扩增l所以使用氯霉素的主要目的，是在不减低质粒产量的前提下，减少细菌的培养体积和细菌的数量．有时质粒在细菌中的扩增状况很差，常是由于质粒携带外源基因或质粒分子量过大所致。二、细菌的收集(bacterialcollection)细胞生长过程中，排出大量代谢产物，为了提高质粒DNA的纯度，离心弃上清，细菌沉淀最好用STE或生理盐水悬浮，漂洗l-2次，离心管壁上的液体也应该仔细去除

4、干净。三、细菌裂解细胞的裂解方法很多，如去污剂法，沸水热裂法、碱变性法，有机溶剂法和溶菌酶法等。不同方法各有利弊，一般要根据质粒性质、宿主菌的特性及后继的纯化方法等多种因素综合后加以选择。质粒提取的方法碱裂解法(Alkaline)煮沸裂解法SDS裂解法其他质粒DNA提取方法的选择l常用的煮沸法，碱法,SDS法均可获得较满意效果．至于有人采用碱法提取小量细菌培养物的质粒，用煮沸法或SDS法进行质粒DNA的大量分离，只是各个实验室的习惯问题.l选择哪种方法制备质粒DNA，应考虑以下因素：1．菌株类型（type）2．质粒的大小(size)3．细菌染色体DNA变性条件强弱的控

5、制(denaturationcondition)质粒DNA的小量制备2-5ml质粒DNA的大量制备500ml大质粒（>15kb）的处理方法：采用温和处理方法，使用蔗糖、溶菌酶、EDTA，后再使用SDS裂解，使plasmid损伤减少小质粒（<15kb）的处理方法：无需特殊处理，碱裂解方法等均可使用四、细菌的裂解和质粒DNA的提取(bacterialandplasmidextraction)在NaOH存在的强碱性（pH12.0～12.6）条件下，用SDS破坏细胞壁和裂解细胞，并使细胞的蛋白质与DNA发生变性，释放出质粒DNA（一）碱裂解法(Alkaline)细胞被裂解后，

6、细胞壁、膜的碎片、变性的蛋白质和染色体DNA形成大的复合物当pH调至中性，质粒DNA重新恢复天然的超螺旋在高盐条件下沉淀，经离心分离，质粒DNA保留在上清液中1在pHl2.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环(CC)质粒DNA仍为自然状态。B将pH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构。大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而CC质粒DNA仍然为可溶状态。C、通过离心，可去除大部分细胞碎片染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。碱裂解法示

7、意图1~4ml培养细菌收集细菌破裂溶解染色体基因组和蛋白质变性、质粒变性变性的细菌基因组形成网状、蛋白质变性、质粒复性SolutionISolutionIISolutionIII分离、纯化质粒DNA碱裂解法提取质粒的试剂及主要成分:(mainregeantsandcomponents)SolutionI:Tris-HCl;EDTA;glucoseSolutionII:NaOH;SDSSolutionIII:CH3COOH碱裂解提取质粒可能存在的问题少量纯化质粒是，多少菌液比较合适？2ml细菌可获得10~15μg质粒加入SolutionII后溶液应该