杂交瘤技术在病理学中的应用

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1、杂交瘤技术在病理学中的应用摘要杂交瘤技术原理和操作过程包含了其许多优点，特异性强、方便、敏感和快速。与其它试验技术联用后，它从细胞，亚细胞和分子水平，动态地把形态变化与功能联系起来并对病原定性、定位及定量。30年来它不断地发展和改进，也为病理学的理论和技术的发展提供了一些新的思路。关键词杂交瘤技术；单克隆抗体；病理学；应用1975年Kohler和Milstein开创了制备单克隆抗体(monoclonalantibody,McAb)的具有划时代的新技术一杂交瘤技术(hybridomatechnique,HT),随P

2、被广泛地应用，这一技术上的突破使血清学的研究快速进入一个高度精确的新纪元。它被认为是“和遗传工程一样，具有巨大生命力和发展前途的新技术(由这一杰出贡献他俩获的1984年诺W尔医学和生理学奖)。它与其他技术在病理学屮的联合应用可以对特异地识别病原，准确地与病原或病变组织的抗原进行定性、定位甚至定量，从而揭示疾病或病变与抗原的关系。1McAb的制备[1’2]1.1原理将一个正常产生抗体的B淋巴细胞与一个赀髓瘤细胞在细胞溶合剂存在的情况H容合成既能在培养基中大量繁殖，又具有脾细胞分泌抗体能力的杂交瘤细胞，再经克隆化形成

3、细胞系后，由于所冇细胞來源于同一前体细胞，分泌的抗体是均一的，它们的结构、氨基酸序列、功能和特异性是一致的McAb，所以制备McAb的技术乂称为來交瘤技术或McAb技术。1.2杂交瘤技术的特性1.2.1不须纯化抗原一些不能纯化的组织(游离)细胞，部分纯化的细胞因子，细胞膜成分和电泳后胶上分离的蛋白带都可直接免疫动物，经克隆化后，筛选所需细胞株，这在研究许多疾病上有重要价值。而蛋0多肽则制成完全福氏佐剂(completeFreund’sadjuvant，CFA)/抗鹿乳剂。由于用不经纯化处于天然状态的细胞抗原免疫动

4、物，则产生针对大然抗原的McAb。1.2.2发现新物质在制备不同病原或组成细胞的McAb吋，往往冇各种各样的抗原特异性杂交瘤细胞株产生，能筛选出新的一些杂交瘤株制备相应的McAb,用于一些新研究。1.2.3特异性强McAb是由同一细胞株分泌的性质均一，高度特异性，且有相同的结构和亲和力，识别同一抗原决定族。这在研究某些物质的局部定位、分型和物质活性检测及肿瘤等疾病诊治都冇重要意义。但由于不同抗原的相同抗原决定簇町能被识别，所以应结合其它实验方法，判断其结果。例如通过相同组织提取物质进行免疫电泳，测定抗原的分子量和

5、确定抗原。1.2.4大批量生产一旦筛选出所需的杂交瘤株，即可大量细胞培养或接种动物产生腹水，测定抗体滴度活通过抗体回收和提纯法，提纯就町以快速地人量稳定的McAb。1.3制备方法细胞抗原或制成完全福氏佐剂/抗原乳剂按一般制备抗体的程序多次免疫试验动物。试验动物常选择：雌性，8-12周龄的BALB/C小鼠，C57BL/6,NEB系小鼠或大鼠。在具体设计免疫方案时，根据所要制的McAb目的和耍求量，考虑抗原的性质、纯度和剂量，佐剂的应用，免疫动物对抗原的免疫应答、免疫途经、免疫次数及免疫间隔吋间。在无茼条件下将所选骨

6、髓细胞和己制备好的脾细胞悬液进行细胞融合培养，通过阴阳性判断和筛选杂交瘤细胞以便及时和准确地产生针对专一性免疫原的杂交瘤细胞。快速和反复多次扩增、冻存和克隆来提高杂交瘤细胞的成活及储备。根据不同的0的而对其特性进行多方面鉴定，例如，分析杂交瘤细胞的染色体和测定McAb的亲和力，以及夹心ELISA鉴定抗体类型。再用大规模的方式培养杂交瘤细胞制备上清液或用小鼠产生腹水，最后纯化为McAb。2病理学中的应用2.1发病学和病变方面研究杂交瘤技术可在组织或细胞水平上应用抗原与McAb特异性结合的免疫学原理进行反应。还可以与

7、多种免疫组织化学方法如免疫荧光法、免疫酶法、免疫胶体金法及放射自敁影法等结合广泛地使用，如在组织细胞内进行抗原定位，识别病原体，祸示病变与抗原的关系

8、31。McAb已应用于检测白血病微小残留病变

9、41。2.2病原学研究15’61病理学诊断和鉴别诊断主要依赖于大体解剖和H.E或辅以某些特殊染色的光镜检测，它们的特异性往往不够。而电子敁微镜技术虽然特异性大大提高，但是耍求非常新鲜的组织样和一系列繁杂的操作过程，丼且取材范围小，设备昂贵。而杂交瘤技术则特异性强，取材方便(可组织或体液)，它还与放射性亲和素相结合，进行放

10、射免疫显像技术，可以对病原及病变进行定位，甚至无创伤性快速诊断和体内示踪诊断l3j。S.Vega等应用杂交瘤技术从两班牙分离出具有抗原特征的牛病毒性腹泻病病毒［7］。2.3临床病理学研究［1］McAb在疾病治疗中有两种可能的放用途径：一种是作为被动免疫而松用，即McAb发挥主要作用，它与病变细胞结合，通过抗体介导的细胞毒性作用(antibodydependentcellm