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《纳米氧化铈放疗增敏及对正常细胞保护作用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、1.细胞细胞对GNPs的摄取(1)取处于对数生长期的A549细胞，接种于25cm2的培养瓶中；⑵待细胞生L<:至70%-80%时，弃去培养液，更换为浓度均为5nl的GNPs培养液，继续培养细胞；(3)药物处理后分别于6，12，24，48h后收集细胞于15ml离心管中。在胰蛋闩酶消化细胞前，弃去1H的培养液，PBS冲洗细胞2次，去除培养液中未被细胞吸收的游离的纳米颗粒。收集细胞悬液，计数细胞总量N}，加入PBS至5ml;(4)加入5ml20%HN03溶液，混合均匀，室温下静置48h充分裂解细胞；(5)ICP
2、-AES测定裂解液屮金原子的质量浓度，按方法计算纳米颗粒的摩尔浓度及纳米颗粒的总数量NGNPso因此每个A549细胞内的纳米颗粒的量n=NGNPs}Nc;(6)实验重复至少3次。2.GNPs在细胞内的分布(1)取处于对数生长期的细胞，接种于25cm2的培养瓶屮；(2)待细胞生长至70%-80%吋，弃去培养液，更换为含冇浓度为5nM的GNPs的培养液，继续培养细胞；(3)24h后弃去培养液，PBS冲洗2次，胰蛋白酶消化后离心收集细胞；(4)电镜标本制作步骤：①固定:在离心所得的细胞团块屮加入2.5%戊二醛2m
3、l固定至少4h;②漂洗：固定后PBS漂洗2次；③脱水:细胞团块脱水按梯度进行，依次为70%丙酮15分钟，80%丙酮15分钟，90%丙酮15分钟，100%丙酮lo分钟(2次)；④浸透和埋:将样本用环氧树脂埋，然后置烤箱烘干，在450C(12小时)、600C(36小吋)烤箱内加温，即可聚合硬化，形成包埋块；⑤超薄切片:将包埋好的蜡块熔粘在特制的木块上，然后固定在旋转切片机上进行一切片；⑥载网:将切片置于直径为3mm的圆形铜网上；⑦染色:预先取一个清洁的培养皿，将石蜡溶解制作成蜡板，然后滴数滴染液于蜡板上用摄子夹
4、住载网的边缘，把贴有切片的一面朝下，使载网浮在液滴上，盖上培养皿，染色10-20分钟。载网从染液中取出后，尽快用蒸馏水清洗干浄；(5)电镜观察、拍片及记录:做好观察记录，选好范围拍片，准确记录底片号码及相应内容，然后在电脑中备案。3.MTT实验检测GNPs对A549细胞的毒性作用(T)取处于对数生长期的A549细胞，以5000/孔的密度接种于9G孔板中；(2)培养过夜,待细胞贴壁生长后,弃旧培养液,加入小同浓度梯度(OnM,5nM,1OnM,20nM)的GNPs培养液；(3)培养24h后，弃培养液，PBS冲
5、洗2次，以去除培养液中游离GNPs,加入新鲜培养液继续培养；(4)MTT实验检测不同时间梯度(24h,48h,72h)细胞的存活分数；MTT的实验步骤：①每孔培养液加入20ulMTT溶液((5mg/mi)，继续培养4h;②止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150ulDMS0,放置摇床低速振荡lOmin,使结晶物充分溶解；③酶联兔疫检测仪检测490/560™处各孔的吸光度值；①下列公式计算各孔细胞的存活率：细胞存活率二(实验组0D值一空白对照组OD值)/(对照组OD值一空0对照组OD值)XI00%②组细胞至
6、少重复3次。1.MTT实验检测GNPs对细胞的放疗増敏效应及对正常细胞保护(1)实验分4组:①对照组，②药物(GNPs)组，③照射(IR)组，④联合组(GNPs+IR);(2)取处于对数生长期的细胞，以5000/孔的密度接种于96孔板中；(3)培养过夜，待细胞贴壁生K后，弃旧培养液，加入不同浓度梯度OnM，5nM，IOnM,20nM)的GNPs培养液；(3)培养24h后，弃培养液，PBS冲洗2次，以去除培养液中游离的GNPs,加入新鲜培养液继续培养；(4)③组和④组行X线照射，剂量为10Gy(6MVX-ra
7、y,SSD100cm,加2cm等效物)；(5)培养24小吋后用MTT法检测各孔细胞的存活率。实验原理及步骤同上。2.细胞克隆形成实验(1)实验分4组:①对照组，②药物(GNPs)组，③照射(1K)组，④联合组(GNPs+IR)，其中③、④组按不同照射剂量分为不同的亚组；(2)将对数生长期的细胞，台盼蓝染色活细胞计数(活细胞比例须＞90%);(3)设定照射剂量分别为OGy,2Gy,4Gy,6Gy,8Gy及lOGy,依照剂量梯度将不同数量的细胞接种于6孔板中(分别为50，200，400,1000,2000,50
8、00);(4)培养过夜，待细胞贴壁生长后，弃旧培养液，②、④组加入浓度为20nMGNPs培养液，继续培养；(5)24h后弃培养液，用PBS冲洗2次，各组均加入新鲜的培养液；(6)③、④组中各亚组按不同剂量梯度进行照射；(7)处理结束•将细胞置于培养箱中继续培养10-14天，注意定期更换培养液;(8)当6孔板屮出现肉眼可见的克隆时，终止培养，弃培养液，PBS洗涤2次，加入纯甲醇固定15分钟。弃固定液，加Gimsa染
