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1、大鼠肾脏冰冻切片的体会张丽娥福建省南平市第二医院病理科福建建阳354200【中图分类号】R587.2【文献标识码】B【文章编号】1001—5302(2015)09-0857-010.引言由于肾脏组织质地柔软，含水量高，或在取材过程中肾组织与水分接触，突遇低温，易形成冰晶，快速冷冻切片的制作难度大，我们通过对大鼠肾脏的冰冻制片，总结经验如下.1材料使用德国产Leica—CM1950型冰冻切片机,Leica—次性刀片，冷冻组织包埋剂(0.C.T.>,AF固定液，改良Gill苏木素染色液,2%碳酸氢钠返蓝液,逐级梯度酒精，中性树胶.2方法2.1取材及埋2.1.1取新鲜大鼠
2、肾脏标木常规取材，标木要新鲜，无需固定，严禁浸入甲醛，酒精,生理盐水等液，尤其是不可以用酒精固定，酒精固定后组织将无法冷冻.2.1.2将样木托放入冰冻切片机的冻台上预冷，加少许O.C.T.，在OCT未完全冻结前快速的将组织放于样木托上，在组织周围适量的补充0.C.T,待包埋剂约1/3未冻结时压上冷冻锤，打幵加强冷冻，使组织快速冷冻.2.1.3冰冻切片机温度设定在一16oC——18oC为宜.冷冻时间一般为1min-2min.冷冻时间过长，组织易变硬变脆，细胞结构会发生改变,难于切片.2.1.4包埋组织时应将组织周边多留出0.C.T.用于牵引展开切片,0.C.T.中的小
3、气泡应尽量去除，以免切片时挤压旁边组织产生皱褶,影响切片效果.2.2切片组织切片厚度设定为5um—6um.刀具提前安放好,调整好刀具角度,切片时控制好操作窗，以利保温.肾脏组织细胞比较致密,若时间过长会变脆且易碎，在冰冻切片时可用手指轻压组织回温,再进行切片.2.3固定切片后立即放入AF固定液固定3Os-1min,不可待切片干后再固定，这样会造成细胞核染色质不清晰，呈现毛玻璃样改变，细胞胞浆边界不清等组织细胞的退变现象.2.4染色封片固定好的冰冻切片在苏木素染液中染色30s—50s,经1%盐酸分化,2%碳酸氢钠水溶液返蓝，伊红染色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶
4、封片.制好的切片核浆对比分明，红蓝适度，颜色鲜艳，达到理想染色效果.3讨论与分析:3.1冰晶是由于冷冻缓慢，冷冻吋间过长，胞质内与组织间隙未结合的水分析出形成的.肾脏因其组织结构，在组织冷冻过程中，组织内易产生大量的冰晶影响冰冻切片的诊断，为了防止组织内冰晶的产生，最佳的办法一是使用冻锤:新鲜标本包埋后放入冷冻台吋，不能将冻锤马上按压在组织上,那样会使组织受挤压变形.应该待O.C.T.凝固60%-70%吋，再将冻锤轻压在组织上，这样既能防止冰晶的产生，又能得到较平整的切面;另一种方法为使用液氮冷冻,可将组织放入液氮中2s—3s,待组织冻至80%吋即可取出制片，否则过
5、冻会引起组织发脆，冻头与组织分离［2］.3.2将包埋剂放入一1OOC或一40C冰箱内保存,包埋剂要使用OCT,而不能用胶水等替代，因OCT的主要成分为PVP,其能通过渗透的作用将细胞内的水分移出，减少冰晶形成.3.3冰冻的速度与样品的表面积和体积成正比，取材时组织块尽可能薄,0.2cm为宜，扁平状冷冻速度快，切片的前几张冰晶少,越后冰晶越多，切片不能求快，而要确保切片质量，力争一次完成一张高质量的切片［1］.3.4可预先做好OCT冻头，将冻头上的OCT修平，冇利于将组织放平，再在冰冻机内在肾组织上滴加OCT,有利于OCT迅速降温，避免组织复温,减少冰晶形成.3.5肾
6、脏冰冻制片吋易产生不规则裂痕，与切片时温度和切片速度有关，操作时应注意操作窗不要开太大，免工作箱的温度升高;OCT的用量太少易产本皱摺/滴加OCT吋要上下俩端多,俩侧少，同吋要注意OCT不要有小气泡.3.6冰冻切片机应安放在冷室内,避免压缩机反复工作，仪器要定期维护，除霜，清洁消毒.总之，冰冻切片技术是病理科最重要的常规工作之一，也是较难掌握的病理实验技术.要做好一张冰冻切片需要病理技术人员具有严格的责任心、严谨的工作态度、丰富的工作实践经验［3］在日常的工作中还需不断摸索经验提高切片质量,冰冻切片不仅要求病理技师在短吋间内制出高质量的切片,还需要病理技师具冇娴熟的
7、技术,对冰冻切片机功能的熟练掌握合理应用.参考文献［1］陈乐真，徐庆中,陈国璋手术中病理诊断图鉴1版北京:科学技术文献出版社,2005:2（还需卷数期数贞码等现在还没査询查询后补上）［2］范慧,陈立华，刘宇冷冻切片的制作体会及常见问题分析.诊断病理学杂志,2008,138（还需卷数期数页码等现在还没查询查询后补上）［3］吴艳霞.冰冻切片的制作方法分析.吉林医学,2009,30（6）:493.
