冰冻切片制备

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1、冰冻切片的制备                                      一、冰冻切片技术的概述（一）优点：1．简便，可以不需要对组织固定、脱水、透明、包埋等手续即可进行切片，减少了一些中间环节。2．快速，用时短。3．组织变化不大。4．能很好保存脂肪，类脂等成分。5．能够比较完好地保存各种抗原活性及酶类，特别是对于那些对有机溶剂或热的温度耐受能力较差的细胞膜表面抗原和水解酶保存较好。（二）缺点：1．不容易做连续切片。2．切取的组织不能过大，组织过大不容易冻结或者组织冻结不均，影响切片及染色效果。3．不容易制

2、作较薄的切片。4．组织块在冻结过程中容易产生水的结晶而影响细胞的形态结构及抗原物质的定位，并且组织结构也不如石蜡切片清晰。（三）主要应用于：1．用于有些水解酶的定位的组织化学方法以及免疫组织化学方法等。2．用于证明脂肪及类脂和神经组织髓鞘的染色时的切片。3．用于临床手术的快速病理诊断。二、冰冻切片机的使用及注意事项（1）新鲜的组织制备组织尽可能新鲜、骤冷愈快愈好，才能避免冰晶，常用的骤冷剂有：①CO2气（－78℃）②丙酮干冰冷却的轻石油醚、乙烷和庚烷（－80℃）③液氮（－190℃）④液氮冷却的丙烷（－19℃）。液氮适用于组

3、织化学，较安全。缺点：组织块易发生龟裂。（2）固定组织的制备为防止水解酶和其他物质的移位、弥散，常用4℃、24小时的甲醛固定能很好地保存酶类。但对许多脱氢酶和转移酶能灭活。故不宜使用，低温，冷甲醛短时间固定（10分钟左右）固定，可显示琥珀酸脱氢酶。电镜出现后，需要保存细胞的超微结构，以4％缓冲戊二醛（25%戊二醛16ml；0.1M二甲胂酸（pH7．）84ml；蔗糖8g）固定较好。这些固定液主要用于水解酶，而不适于许多氧化还原酶和转移酶。（3）恒冷箱温度一般在冷冻后10分钟，到接近冷室温度时再切，一般组织在－15～－20℃切

4、片最易成功。每种组织有其合适的切片温度、刀的温度和冷室温度，Pearse及Bancroft的经验如下：组织刀温度组织温度恒冷箱温度肝-18-10-5肾-15-8-5皮肤-35-10-5脑-18-5-5固定组织一般高3-5度（4）抗卷板抗卷板的前缘与刀面须有足够的距离，使切片平滑通过。抗卷板略高于刀面的最高点。可凭经验调整刀对组织的角度，一般新刀为20゜（5）切片机操作程序：先接通电源，调定恒冷箱温度，调整切片刀的角度，调定切片厚度，标本置载台致冷达所需温度后，将其安放在切片机推进器上。即可切片。恒冷箱视使用情况每周或每月清

5、洁一次冰霜。（6）切片刀新刀切片满意，旧刀用自动磨刀机磨刀较好。如果切片刀与抗卷板的位置，角度合乎要求，又有一把锐利的刀，就能获得理想的切片。三、冰冻干燥原理为冰冻组织保持高度真空，直到去除组织中的水分。过程小块组织骤冷→立即在真空干燥脱水（－30～－40℃）冰升华，水气去除，不会发生酶的弥散→材料干后，升到室温浸于石蜡或碳蜡包埋。特点能出色地保存组织的酶活性，还有助于保持组织的结构。但仪器贵，需时长。四、冰冻替代法原理低温下用液体脱水剂取代组织中的水分。过程组织块骤冷→组织内的水，在低温（－40℃～－70℃）液体脱水剂中

6、被替代（醇、丙酮），同时起到固定作用→脱水组织渐恢复到室温，用石蜡包埋。特点①新鲜组织在24小时内制成切片②可保存较多的酶活性③经济、简单且有重复性，但对细胞器保存不佳，不能用于电镜。