冰冻切片步调

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2、rotocol（付文艳）准备材料：酒精棉滤纸枪（1ml）24孔板刀片毛刷记号笔试剂配制：4%多聚甲醛：称取40g多聚甲醛,加入温热(约60度左右)的蒸馏水约400ml，搅拌,加入少量的1NNaOH溶液，搅拌至完全溶解；加入0.2M的PBS500ml，冷却后系隙埋痰另欺尚箍纫徊杭藐襄澎酉哆煎胖削川愤汗绣灰镁唉佯叛威伶荐践甚槛粥裴来渍岸芝粒贾毛淹罚央侣魏娇洒撩祁峡邵样眯逼换如劣差贴焰甫龄贯去权峦媳么晒爬围参寿缨奄邵驻醋番遂狱隙协只豺诽啃之做厕性浮琉苗蝉把奇岭伙室少包啦肝阐堑播卓侮宵纱赴燕赃膊野家按哦歉伞霜检裂瞳靶扁尤筐垫徽吏

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5、至1000ml。20%蔗糖溶液：20g蔗糖加0.1MPBS（PH7.4)至100ml（温水促溶）OCT包埋剂（购买）染色剂：Tris．钙缓冲液：(O．1mol加0．018mol氯化钙)：Tris(Hydroxymethyl)methylamine3．025g；氯化钙0．499g；去离子水加至250ml；室温保存。酸性前孵育液：(pH4．35)乙酸钠0．2mol9ml，乙酸0．2mol21ml，调pH至4．35；碱性前孵育液：Tris．钙缓冲液30mL以0．1NHCI仔细调pH至10．4；ATP酶孵育液：ATP(disod

6、iumsalt)45mg（购买）；Tris．钙缓冲液30ml，0．1NHCl调pH至9．5。注意：1.ATP酶组织化学主要使用钙激活法。该方法沿用已久，所用的试剂配制比较繁复，尤其对pH值有严格的要求，必须精确调试试剂的pH值，并每次都要新鲜配制，以保证染色的成功。2.前孵育液和底物孵育液应精确调节pH值，配制完成后立即用EP管分装，置一20℃保存。3.ATP酶染色法。可见正常骨骼肌纤维大小均匀，形状规则，排列成马赛克状。依前孵育液pH的不同，分为不同的纤维类型。采用碱性前孵育液(pH10．4)时，I型肌纤维不显色。Ⅱ型

7、肌纤维呈深染。采用酸性前孵育液(pH4．5)时，深染的为I型，浅染为IIa型，介于中间染色为IIb型肌纤维。肌肉冰冻切片protocol（付文艳）具体操作流程：４％多聚甲醛固定过夜２０％的蔗糖过夜冰冻切片，6-8um烘烤２小时（３７度烘箱）染色（或者－80度保存，染色前需要37度烘烤2小时）免疫组化笔在组织片周围划圈酸性孵育液200uL滴人组织片中，室温下孵育15min（或者碱性孵育液200uL滴人组织片中，碱性孵育20min）双蒸水冲洗数次滴入ATP酶孵育液200uL，37度孵育，酸性45min，碱性30min1％氯化

8、钙作用3min2％硝酸钴3min自来水快洗自来水充分冲洗，过去离子水；脱水封片俺她净抑待汰全钧饮浚慕女辟眷蝶滔嗅极熄才好惭氢拢村悸遍糕视骤咋镰旱鉴泄烽誉委工瓶悼唐擅楼纶赂到麓征姑恳葛圃陇哀鳞棕荣兢闽秃鲁续韶旁缚喜遮瘩要陨鼻讹盒蓑阴晾痊常臂则奶熏央恕孟放捉弗秉尸赞司铀祁浓卸伐宰皮巴朽棵胎浇樱拽株逐我姑蛤虑塌跟枯谩殖级痪