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1、南瓜蛋白与STI571体外联合抗K562细胞的作【摘要】目的探讨南瓜蛋白与STI571对K562细胞增殖的抑制作用及其机制。方法用MTT检测南瓜蛋白与STI571单用或联合作用对K562细胞增殖的抑制作用;流式细胞仪检测药物对细胞的凋亡率;osinandSTI571.L)和急性淋巴细胞白血病(ALL),疗效显著［5-6］。笔者探讨南瓜蛋白与STI571联合抗K562细胞的作用及其机制。1材料与方法1.1材料1.1.1药品与试剂南瓜蛋白由本课题组制备,纯度>95%。STI571(瑞士诺华公司)经萃取、重结晶
2、所得,纯度达99%,溶解于DMSO中,配成10mmol/L,于-20℃储存备用。抗c-Abl抗体(美国SantaCruz公司)。1.1.2细胞株及培养条件人慢性粒细胞白血病细胞株K562(中国科学院上海细胞研究所),培养于含10%小牛血清、1×108U/L青霉素、100mg/L链霉素的RPMI1640培养液,在37℃、体积分数为0.05的CO2条件下培养。细胞接种24h后进入指数增长期。1.2方法1.2.1南瓜蛋白单独或联合STI571对K562细胞的抑制作用K562细胞悬液200μL［(2～4)×109L-1
3、］,加入96孔板中,分别设空白组、不同浓度药物组及加等量溶剂阴性对照组,每个浓度重复4孔,无细胞孔为背景,各孔终体积相同。将培养板置于37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱培养48h,以MTT法测定联合用药对细胞增殖的抑制作用。1.2.2南瓜蛋白联合STI571诱导K562细胞凋亡的作用收集药物处理的细胞,根据凋亡检测试剂说明书操作;流式细胞仪(FCM)分析凋亡细胞百分率(sub-G1%)。1.2.3检测南瓜蛋白与STI571诱导K562细胞凋亡的百分率2.3南瓜蛋白联合STI571对K562细胞p210Bc
4、r-Abl的影响单独0.2μmol/LSTI571作用48h,p210Bcr-Abl含量变化不明显,而单独用1.25μg/mL南瓜蛋白作用48h,K562细胞p210Bcr-Abl蛋白含量减少,而两药合用减少明显,说明两药合用对K562细胞p210Bcr-Abl蛋白含量影响起协同作用(图2)。3讨论STI571是Bcr/Abl融合蛋白酪氨酸激酶(TK)活性的竞争性抑制剂,在治疗Ph阳性的慢性粒细胞白血病方面具有独特的作用机制和高效的特异性［5-6］。体外实验表明,STI571可抑制K562细胞增殖并诱导其凋亡［
5、7-9］。核糖体失活蛋白(RIP)广泛存在于高等植物中,按照结构可分为I型和Ⅱ型RIP［13］,具有抗生育、抗病毒和抗肿瘤等多种生物学活性［14-16］。南瓜蛋白属于I型核糖体失活蛋白,本课题组前期研究表明,它具有抗肿瘤和促分化作用［1-4］。不论是MTT法测定药物体外杀伤作用,还是以诱导细胞凋亡为指标,南瓜蛋白与STI571在体外均有相加或增强作用,绝大多数联合用药组的q>1.15,表明二者的协同主要表现为协同作用。由于STI571主要针对蛋白酪氨酸激酶的抑制作用,对p210Bcr-Abl蛋白含量影响较
6、少［17-18］,本实验结果与之一致；而南瓜蛋白则不同,从本实验结果看,南瓜蛋白单独作用可抑制p210Bcr-Abl的蛋白含量。因此南瓜蛋白可下调K562细胞p210Bcr-Abl蛋白水平,提示两药通过不同方式对K562细胞p210Bcr-Abl的TK活性及含量产生作用。通常两药呈现协同作用往往是因为二者具有不同的作用机制。笔者认为,南瓜蛋白可能是通过其核糖体失活作用,从而影响蛋白质表达,引起蛋白含量减少,但是有关机制需进一步证实。从目前结果分析,南瓜蛋白影响p210Bcr-Abl的含量,从而进一步影响了p21
7、0Bcr-Abl的蛋白酪氨酸激酶及其下游信号分子传递,最终协同抑制K562细胞增殖。南瓜蛋白与STI571具有协同抑制K562细胞的增殖作用,这种作用与南瓜蛋白影响p210Bcr-Abl表达的机制有待进一步研究。【4］GirbesT,FerrerasJM,AriasFJ,etal.Description,distribution,activityandphylogeicrelationshipofribosome-inactivatingproteinsinplants,fungiandbacteria［J］.
8、MiniRevMedChem,2004,4(5):461-466.［15］ParikhBA,TumerNE.Antiviralactivityofribosomeinactivatingproteinsinmedicine［J］.MiniRevMedChem,2004,4(5):523-543.［16］ZhangKZ,XuJH,HuangXechanismofresistancetot
