关于冰冻切片的若干问题

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1、L做冰冻切片用的固定后样品能在蔗糖溶液放多久?问：本人将样品固定过后冲洗过后，放入蔗糖溶液，因有事耽搁，放了一个星期了，不知是否还可切片.还有固定过后冲洗用普通蒸馏水冲洗可以吗？我是做免疫组化答：1、不知道你放置的蔗糖浓度是多少，如果是30%最好是三天之内，50%的浓度可以方久一点，一两个月应该没什么问题。因为蔗糖是高渗环境，不会影响实验结果。祝好运吧！2、我认为组织在20%蔗糖放一周还是可以切片的，至于固定后的冲洗，可以免掉，也可用0.01MPBS涮洗一下，蔗糖液的量要多加一些2、关于冰冻切片的问题（冰冻切片，免疫荧光，蔗糖，脱水）问：请拟准备做免疫荧光

2、的标本，经前固定灌注后取全脑，后固定4小时后，30%的蔗糖脱水过夜，再用0CT包埋后保存在-80的冰箱，冰冻切片后HE染色，发现整个视野都是大小不等的圆形洞洞，不知道是什么原因.答：1、个人认为可能是以下几个方面的问题：30%的蔗糖脱水过一般我所采取的是灌注固定后取脑，然后放入30%蔗糖的多聚甲醛溶液中，待脑下沉到底后（大约2天）再切片，用这样的高渗糖既可以防止冰晶又可以继续后固定.单纯的蔗糖过夜应该是不够的•从30%蔗糖的多聚甲醛溶液中捞出脑后应放入液氮迅速冷冻然后进行切片，不建议用-80度冰箱，曾经用过-80度冰箱结果脑片出现许多冰晶孔.2、用0.01

3、M的PBS配置的4%多聚甲醛灌注固定后，20%蔗糖（沉底）一30%蔗糖（沉底），然后直接进冰冻切片机急冻15~20min，我们实验室的技术员曾说过，脑标本千万不能用0CT包埋、液氮冷冻。只要蔗糖脱水彻底，是不会形成冰晶的；而用0CT包埋、液氮冷冻，你没做过，时间不好把握一一时间长了，组织会冻裂；时间不够，冷冻效果不好，切片不好切。3、这个就是实验室和实验室操作方法有所区别了，我说的方法肯定是没有问题的，我们都是这样操作没有出现过冰晶，不用0CT包埋，但确实用液氮，冻10秒，不会冻裂，效果良好.4、液氮速冻可以防止组织冰晶的形成冰冻切片心得1.取脑一定耍在冰

4、上操作，液体也一定用冷的2.30%蔗糖一定要充分，最好中间换液一次，20%的可以不做3.沉淀后冻存，一定要快冻，最好在干冰上操作.4.最重要的一点，灌注的时候，不要用0.1MPB，用0.01MPBS.以前不知道，很多书上写的都是0.1MPB，后来自己用了发现还是有洞.为了这个，我还专门作了对照实验，结果0.01MPBS更好一些，原因不知道为什么，但是事实如此.（理论上高浓度液体更利于保护细胞不会因为冰冻损伤）1.如果做磷酸化的抗体，一定记得在灌注液里加一定的抑制剂，如NaF等.如果是全脑的话，放在30%蔗糖（PBS或PB配）中沉底会很慢，我们都用双蒸水配，

5、先20%沉底，再30%沉底，想要沉底快可将脑先切成小块。其实我做过很多次只用20%沉底，30%泡过感到冇点粘粘的，切出的片子容易卷,不好展开。要切片没有洞关键要速冻，切片机闲时一般温度较高，使用时把温度调到切片温度，先不将脑块放入，待温度降低后再放入以达到速冻的效果。我做切片的时候，先用20%蔗糖（PB配）沉底，再用30%蔗糖沉底，这样脱水比较充分。一般是等切片机温度达到_22度之后，再将包埋好的脑组织放入。脱水不充分也会导致切片有洞，而且片子容易向内卷，很不好贴。一直这样做了很久，效果都还不错。防止脑袋冻碎办法：先准备好一个保温杯，倒入适量的液氮，然后在

6、杯身中放一个纸杯（塑料或玻璃杯禁用），再在杯屮放一金属片，以防止纸杯翻倒，动物脑袋取好后，先放在一张小锡箔纸上，然后连锡箔纸一起转移至杯中的金属片上面，盖上保温杯盖，3-5分钟后，见大脑表片颜色变白，表示冷冻完全，随即将大脑用锡箔纸包好，转入-80度冰箱长期保存。脑片切好后保存方法：1、先用手指在玻片（己挂好胶）后均匀轻轻过一下，将脑片组织贴在玻片上。2、37度干燥箱中烘干。3、放入切片盒中/'盖紧盒盖，并用胶带将切片盒封严，外用样品袋包扎严实，即可防止水汽进入。于-20度可保存半年以上，于-80度可保存一年以上。切忌经常打开盒子。0.01MPBS配方(p

7、H7.2-7.4)(500ml)Na2HP04*12H202(分子量358.14)2.9gNaH2P04*2H202(分子量156.01)0.295gNaCl4.5gddH20500ml混匀，完全溶解后，用143?04调1%值至口147.2〜7.4。用前配制或者于4度短期保存。