实验2 淀粉酶活力测定

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1、实验2淀粉酶活力的测定【摘要】本次试验目的在于通过实际的操作与观察，掌握酶活力测定的方法以及巩固分光光度计的使用。根据淀粉酶催化淀粉水解产生的葡萄糖、麦芽糖等还原糖能够与3,5-二硝基水杨酸作用，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，通过分光光度计测定棕红色溶液的吸光度值，并与标准葡萄糖-吸光度值曲线进行对比，即可知道实验中生成的还原糖的量，从而测定酶活。比对试验结果，发现本组的实验数据与别组的存在一定差别，本次实验所得结果欠佳。【材料与设备】如表1所示表1淀粉酶活力测定实验材料设备一览表试剂仪器 玻璃器皿 稀释200倍的淀粉酶原液 风光光度计 试管（16根葡萄糖溶液 恒温水浴锅 移液枪，枪

2、头 洗脱峰1.2.3电磁炉 移液管 3,5-二硝基水杨酸 试管架 1%淀粉溶液 【实验步骤】1.葡萄糖标准曲线的测定（1）取7支试管，按如下表2所示，加入试剂　　　　　　　　　表2葡萄糖标准曲线加样表试剂管号1234567葡萄糖标准液（ml）00.10.30.50.70.91.0蒸馏水（ml）1.00.90.70.50.30.103,5-二硝基水杨酸（ml）1.0(2)将各管摇匀，置于沸水浴(3)取出试管，冷却近室温，加入8ml蒸馏水（4）以1号管为对照，测定各管在540nm下的吸光度，并记录2.酶活力的测定（1）四组样品（稀释200倍的酶原液、洗脱峰1、洗脱峰2、洗脱峰3）分别按照如下

3、表3操作进行，即每个样品测两管，对照组缓冲液只需测定一管表3酶活力测定加样一览表操作项目编号1-11-2缓冲液添加酶液（ml）0.10.10.13,5-二硝基水杨酸（ml）001.01%淀粉溶液(ml)0.90.90.9酶解反应40℃,10min100℃,5min3,5-二硝基水杨酸（ml）1.01.00沸水浴5min定容加入8ml蒸馏水（2）将各管摇匀后，于540nm下测定吸光度值，并记录【实验结果】1.原始数据记录(1)葡萄糖标准曲线的测定：原始数据记录如表4所示表4测定葡萄糖标准液吸光度原始数据记录表试管号1234567葡萄糖含量(ml)00.10.30.50.70.91.0A54000

4、.1550.1690.2780.3660.5210.596（2）酶活力测定：原始数据记录如表5所示表5酶活力测定原始数据记录表样品稀释200原酶液洗脱峰1洗脱峰2洗脱峰3缓冲液试管编号原-1原-21-11-22-12-23-13-21吸光度值A5401.2131.1300.3190.3970.8110.8090.3980.3690.2781.数据处理（1）葡萄糖标准曲线的绘制所以，葡萄糖标准曲线方程为y=0.0968x+0.0291（1）（2）酶活力的测定以洗脱峰2的一组数据为计算示例：平均吸光度A1=(0.811+0.809)/2=0.8065纯吸光度A2=0.8065-0.278=0.52

5、85带入式子（1）即0.5285=0.0968x+0.0291解得x=5.16umol所以实验中0.1mol洗脱峰生成还原糖的物质的量为n=5.16umol本实验中规定每min生成1umol的还原糖为1U所以0.1ml洗脱峰2的酶活为5.16/10=0.516U1ml洗脱峰2的酶活力为0.516*10=5.161U/ml其余计算结果汇于下列表6中表6酶活力测定实验结果记录表样品稀释200原酶液洗脱峰1洗脱峰2洗脱峰3酶活力（U）8.930.535.160.79【讨论】1.经过本次实验，基本掌握了酶活力测定的一种方法，也更加熟练的对分管光度计进行了操作。实验当中，有一些需要注意的地方：首先，要严

6、格控制实验的酶解反应时间以及温度，因为温度和反应时间是影响酶活性的关键因素此外，由于加入的底物淀粉中本身也含有葡萄糖，所以实验需要设置对照组，来扣除底物中葡萄糖对实验结果的影响。1.在与别的组对比的过程中发现，本次实验结果数据波动很大，缓冲液所测得的数据结果偏小，可能原因是5min煮沸的时候未控制在沸点，变成5min加热至沸的情况，造成反应不彻底。洗脱峰1和洗脱峰3的数值与别组相比，偏小比较多，可能原因是加热过程发生问题，也可能是试剂在添加的过程中出现了管内气泡，造成实际加入的试剂量减少，从而引起误差。2.除了采用上述的生糖法来测定之外，在实际当中还有其余方法可以选择，一是测定底物淀粉的消耗量

7、；二为色原底物分解法，三是酶偶联法【1】。其中，方法一中的碘-淀粉比色法是最为常用的方法，该方法是根据淀粉遇碘变蓝的原理而设计的，在底物淀粉浓度已知且过量的条件下，反应后加入碘液与未被催化水解的淀粉结合成蓝色复合物。其蓝色的深浅与未经酶促反应的空白管比较成比例，从而计算出淀粉的量，推算出淀粉酶活力【结论】此次实验存在着一定的操作误差，误差来源主要是对反应时间的控制，在恒温水浴时间到后，没有立即取出