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1、淀粉酶活力测定实验报告实验三、淀粉酶活性的测定实验报告实验四、淀粉酶活性的测定一、实验目的：1、了解α-淀粉酶和β-淀粉酶的不同性质及其淀粉酶活性测定的意义；2、学会比色法测定淀粉酶活性的原理及操作要点。二、实验原理：淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。根据α-淀粉酶和β-淀粉酶特性不同，α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化；β-淀粉酶不耐热，70℃15min则被钝化。测定时，使其中一种酶失活，即可测出另一种酶的活性。淀粉在淀粉酶的催化作用下
2、可生成麦芽糖，利用麦芽糖的还原性与3,5-二硝基水杨酸反应生成棕色的3-氨基-5-硝基水杨酸，测定其吸光度，从而确定酶液中淀粉酶活力（单位重量样品在一定时间内生成麦芽糖的量）。三、实验用具：1、实验设备研钵,具塞刻度试管,离心管，分光光度计，酸度计，电热恒温水浴锅，离心机，电磁炉。2、实验材料与试剂（1）0.1mol/lpH5.6的柠檬酸缓冲液：A液：称取柠檬酸20.01g，定容至1000ml；B液：称取柠檬酸钠29.41g，定容至1000ml；取A液55ml与B液145ml混匀。（2）1%可溶性淀粉溶液：1g淀粉
3、溶于100ml0.1mol/lpH5.6的柠檬酸缓冲液；（3）1%3,5-二硝基水杨酸试剂：称取3,5-二硝基水杨酸1g、NaOH1.6g、酒石酸钾钠30g，定容至100ml水中，紧盖瓶塞，勿使CO2进入；（4）麦芽糖标准溶液：取麦芽糖0.1g溶于100ml水中；（5）pH6.8的磷酸缓冲液:取磷酸二氢钾6.8g,加水500ml使溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8，加水稀释至1000ml即得。（6）0.4mol/L的NaOH溶液；（7）1%NaCl溶液。（8）实验材料：萌发的谷物种子（芽长约1c
4、m）四、操作步骤1、酶液提取：取6.0g浸泡好的原料，去皮后加入10.0mL1%的NaCl溶液，磨碎后以2000r/min离心10min，转出上清液备用。取上清液1.0ml，用pH为6.8的缓冲溶液稀释5倍，所得酶液。2、a-淀粉酶活力测定(1)取试管4支,标明2支为对照管,2支为测定管。(2)于每管中各加酶液lml,在70℃士0.5℃恒温水浴中准确加热15min,取出后迅速用流水冷却。(3)在对照管中加入4m10.4mol/L氢氧化钠。(4)在4支试管中各加入1mlpH5.6的柠檬酸缓冲液。(5)将4支试管置另一
5、个40℃士0.5℃恒温水浴中保温15min,再向各管分别加入40℃下预热的1％淀粉溶液2m1,摇匀,立即放入40℃恒温水浴准确计时保温5min。取出后向测定管迅速加入4ml0.4mol/L氢氧化钠,终止酶活动,准备测糖。3、淀粉酶总活力测定:取酶液5ml,用蒸馏水稀释至100m1,为稀释酶液。另取4支试管编号,2支为对照,2支为测定管，然后加入稀释之酶液lml，在对照管中加入4m10.4mol氢氧化钠，4支试管中各加1mlpH5.6的柠檬酸缓冲液。以下步骤重复α-淀粉酶测定第（5）步的操作,同样准备测糖。4、麦芽糖
6、的测定(1)标准曲线的制作:取25ml刻度试管7支,编号.分别加入麦芽糖标准液（lmg/ml）0,0.2,0.6,1.0,1.4,1.8,2.0ml,然后用吸管向各管加蒸馏水使溶液达2.0ml,再各加3,5一二硝基水杨酸试剂2.0m1,置沸水浴中加热10min.取出冷却,用蒸馏水稀释至25m1。混匀后用分光光度计在520nm波长下进行比色,记录吸光度，以吸光度为纵坐标,以麦芽糖含量（mg）为横坐标,绘制标准曲线。(2)样品的测定:取步骤2,3中酶作用后的各管溶液2m1,分别放入相应的8支25ml具塞刻度试管中,各加
7、入2m13,5-二硝基水杨酸试剂.以下操作同标准曲线制作。根据样品比色吸光度平均值,从标准曲线查出麦芽糖含量,最后进行结果计算。五、结果处理式中A为a-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖（mg）；Ao为a-淀粉酶的对照管中麦芽糖量（mg）；B为（a十β）淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖（mg）；Bo为（a十β）淀粉酶的对照管中麦芽糖（mg）；VT为样品稀释总体积（ml）；VU为比色时所用样品液体积（ml）；NaOH溶液、萌发的小麦种子2.实验步骤（1）初始酶液的制取（30min）2g萌发的小麦种子→少量石英砂，研磨至匀浆→少
8、量多次用蒸馏水转移到50ml容量瓶至40ml→颠倒浸提15~20min→定容至刻度→混匀→3500r/min离心20min→上清液（2）α-淀粉酶活性的测定（50min）取所制取的酶液5ml，放入100ml容量瓶中，定容至刻度，混合均匀得到稀释后酶液。（4）麦芽糖含量的测定α-淀粉酶活性（mg麦芽糖·min-1·g-1鲜重）=[（A-A’）×样品稀释总体积]
