乳腺肿瘤克隆性检测方法的比较

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1、乳腺肿瘤克隆性检测方法的比较作者：于琦,牛昀,丁秀敏,于泳,史玉荣,肖绪祺【关键词】乳腺肿瘤；克隆性检测；聚合酶链反应；普通PCR；巢式PCR0引言根据肿瘤的单克隆性，我们曾采用巢式PCR扩增DNA,用于研究乳腺癌癌前病变的早期诊断。我们将克隆性检测中所用聚合酶链反应的两种方法—普通PCR(GPCR)和巢式PCR(NPCR)的检测结果做一比较，以期找到更为简便、实用的方法。1资料与方法1.1临床资料选择天津医科大学肿瘤医院乳腺病理室2000～2004年间存档的乳腺一般性增生（Usualductalhyperplasia,UDH）和

2、/外周型乳头状瘤（Peripapilloma,periPM）、不典型增生(Atypicalductalhyperplasia，ADH)和/periPM伴ADH及导管内癌(Ductalcarcinomainsitu,DCIS)石蜡包埋组织各30例，正常组织20例，均为女性，年龄19～72岁（中位49岁）。1.2研究方法1.2.1GPCR反应按朱少君等[1]报告的方法，提取DNA，并取1μg，按反应体系（HhaⅠ内切酶1μl、10×M缓冲液2μl、牛血清蛋白0.2μl加灭菌水至20μl）37℃消化3h，65℃20min终止反应，自然

3、冷却。取消化后的DNA10μl，加PremixTaq25μl、引物AR1A和AR1B各2.2μl、加灭菌水至50μl反应体系（未经消化的DNA按以下公式换算：所加DNA（μl）=1/2消化时所需DNA（μl），再用灭菌水补足10μl）。按反应条件：97℃预变性7min、94℃变性40s、56℃退火50s、72℃延长1min，共35个循环，72℃延长15min。1.2.2NPCR反应取5μlGPCR扩增产物,用灭菌水稀释至500μl,然后取10μl稀释的DNA加引物AR2A和AR2B（反应体系同GPCR加至50μl）进行NPCR

4、反应(反应条件同GPCR)。AR1A：5’GAGGAGCTTTCCAGAATCTG3’;AR1B：5’CATGGGCTTGGGGAGA3’;AR2A：5’TCCAGAATCTGTTCCAGAGC3’;AR2B：5’TGGGGAGAACCATCCTCACC3’1.2.3琼脂糖凝胶电泳评价扩增效果，变性聚丙烯酰胺凝电泳，比较GPCR和NPCR的结果。1.2.4统计学分析采用配对四格表χ2检验。2结果2.1琼脂糖凝胶电泳显示GPCR扩增条带清晰，与NPCR相同，见图1。2.2变性聚丙烯酰胺凝胶电泳比较扩增情况正常组织、UDH和/p

5、eriPM酶切前后无明显变化，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳在200bp与300bpDNA泳动位置间显示2条带，说明具有AR位点的多态性，是多克隆的；导管内癌组酶切后两条带中的1条明显减弱或消失，显示出Ｘ染色体失活嵌合性的丢失，属于单克隆性增生；在ADH和/periPM伴ADH样本中，一部分显示多克隆的，而一部分是单克隆的。分别用NPCR、GPCR扩增产物进行以上实验过程，并逐例比较经NPCR和GPCR后在电泳图上显示的带型。两种方法均扩增成功的样本电泳结果相似，显示扩增效果是一致的,见图2。2.3各组样本GPCR和NPCR的

6、扩增成功率比较见表1。M：Marker；1：normalbreasttissue；2：PeriPM；3和4：PeriPM伴ADH；5和6：DCIS图1琼脂糖凝胶电泳图（略）M是Marker,每相邻两个泳道如1和2、3和4、5和6、7和8是同一样本酶切前后的带型图2经NPCR和GPCR扩增各组病变的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图（略）3讨论最近10年,基于Ｘ染色体多态性为基础的克隆性分析技术已经逐步得到完善,已成为一种重要的分子病理学手段,其中聚合酶链反应技术发挥了无法估量的作用。聚合酶链反应技术简称PCR技术，是一种利用DNA变性和

7、复性原理在体外进行特定的DNA片断高效扩增的技术，PCR技术不但能有效地检测基因的突变，而且能准确检测癌基因表达量。例如有研究报告CD44基因的异常拼接表达，几乎100%出现于某些泌尿系肿瘤，而对照组完全没有这种异常表达[2]。巢式聚合酶链反应（NPCR）也称套式PCR。在这种技术中，首先用一对外引物进行第一轮PCR，然后再使用第一对引物扩增的DNA序列内部的一对引物再次扩散，所以称为巢式PCR。由于使用了两对引物并且进行了两轮扩增反应，因此我们一般认为试验的敏感性增强。巢式PCR应用较广，比如在孕妇外周血中扩增男性胎儿单拷贝序列D

8、NA,即DYS14基因，可以作为性相关基因疾病的产前诊断方法[3]；检测肉芽肿中副结核分支杆菌，用以探讨Crohn’s病的发病机制[4]；而且还能用于检测潜在的肿瘤标志物，Ioannidis等[5]利用巢式PCR在58.