三氧化二砷抗肝癌血管新生作用

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1、三氧化二砷抗肝癌血管新生作用【摘要】目的：　探讨三氧化二砷（As2O3）注射液抗肝癌血管新生的作用及其相关机制。方法：采用MTT法、透射电镜观察、免疫组化、鸡胚尿囊膜（CAM）血管形成实验等方法，观察As2O3注射液对人肝癌细胞株SMMC7721和人脐静脉内皮细胞ECV304生长、超微结构、血管内皮生长因子（VEGF）和表皮生长因子受体（EGFR）蛋白表达以及对CAM血管形成的影响。结果：As2O3能显著抑制人肝癌细胞SMMC7721和人脐静脉内皮细胞ECV304生长，用药后诱导其出现了典型的细胞凋亡超微结构改变；As2O3对SMMC7721细胞和ECV304细胞VEGF、EGFR的

2、表达均有抑制作用；As2O3能抑制CAM血管形成。结论：　As2O3注射液具有显著抗肝癌血管新生作用，其机制与抑制血管内皮细胞生长、诱导血管内皮细胞凋亡、调控肿瘤血管新生相关因子VEGF和EGFR的表达密切相关。【关键词】三氧化二砷肝癌血管生成自20世纪70年代以来，人们已发现肿瘤的生长有赖于血管新生，肿瘤组织中的新生血管不仅为瘤体提供氧分，而且为肿瘤转移及血管浸润提供通道，故血管新生与肿瘤生长、转移密切相关［1］。进一步的研究证实，肝癌为丰富血供实体肿瘤，其生物学特性包括高度血管浸润及转移倾向，并导致该疾病的不良预后。血管新生理论的建立，不仅为深入探讨肝癌的发病机制找到了一条新思路，也为

3、探寻该病的治疗方法提供了新策略［23］。鉴于肝癌是典型的多血管肿瘤，其转移复发与肿瘤血管形成有关，抗肿瘤血管形成治疗对肝癌转移复发的干预有特殊意义。我们已发现三氧化二砷（As2O3）注射液具有抗肝癌作用，其作用机制包括细胞毒、诱导癌细胞凋亡和抑制癌细胞端粒酶活性等［46］。本研究进一步探讨As2O3注射液是否具有抗肝癌血管新生作用，为临床治疗用药奠定实验基础。1材料与方法1.1细胞株人肝癌细胞株SMMC7721和建株人脐静脉内皮细胞ECV304，均引自中国科学院上海细胞生物研究所。1.2药物与试剂0.1%As2O3溶液，即亚砷酸注射液（哈尔滨伊达药业公司产品,批号20030801），

4、使用时以RPMI1640培养液稀释至所需浓度。RPMI1640培养液含10%新生小牛血清和青、链霉素各100×103U·L-1。四甲基偶氮唑蓝（MTT）购自Fluka公司，用PBS溶液将其稀释至5g·L－１，压滤除菌,4℃避光保存。鼠抗人血管内皮生长因子（VEGF）、表皮生长因子受体（EGFR）单克隆抗体，为福建迈新生物技术开发公司产品。鸡胚购自南京制药机械厂。M450甲基纤维素为美国Sigma产品。1.3细胞形态学观察1.3.1倒置显微镜观察取对数生长期的细胞按1×109L-1接种于培养瓶中，待细胞完全贴壁后加药处理(As2O3终浓度分别为1、2、4mg·L-1)，对照组加入等体积的

5、培养液，然后培养至预定时间，用倒置显微镜观察细胞生长状况和形态学改变。1.3.2透射电镜观察取对数生长期的人脐静脉内皮细胞ECV304按1×109L-1接种于培养瓶中，待细胞完全贴壁后，给药组加入不同浓度的药物，对照组加入等体积的培养液，继续培养。加药后48h收集细胞，4%戊二醛固定2h，0.1mol·L-1磷酸缓冲液漂洗，1%四氧化锇作用后固定，梯度酒精脱水，Epon812包埋剂包埋，切片机切成薄片（切片厚度在50nm左右），醋酸铀和柠檬酸铅双染色，透射电镜观察。1.4细胞生长检测取3×107L-1的活细胞接种于96孔培养板中，每孔100μl，设4复孔，待细胞贴壁后分别加入不同浓度的A

6、s2O3溶液，100μl·孔-1，对照孔加入100μl培养液。置于37℃，5%CO2培养箱中培养至预定时间，每孔加入100μl0.04mol·Ｌ－１盐酸异丙醇，微型振荡器振荡5～10min使结晶完全溶解，在酶联仪波长570nm处测定各孔吸光度（OD）值，按下列公式计算细胞生长抑制率：抑制率（%）=（1-加药孔平均OD值/对照孔平均OD值）×100%。实验重复3次。1.5免疫组化检测按SP免疫组化试剂盒说明书操作，观察细胞VEGF和EGFR蛋白的表达情况。1.6鸡胚尿囊膜(CAM)血管新生取种鸡场孵化的7日龄胚蛋，随机分为2组，每组25只蛋。在照卵灯下寻找胚头右下方血管稀少区，划定1cm×1

7、cm圆形开窗位置，在鸡胚气室端钻直径1mm小孔并穿透壳膜。用75%乙醇消毒开窗部位，使用手术剪轻轻揭去蛋壳及壳膜，暴露出CAM，将甲基纤维素碟放置于CAM上血管较少的部位，用微量进样器将各组药物滴入甲基纤维素碟中。处理方法：As2O3组浓度20mg·L-1、阴性对照组用生理盐水，各组滴入量20μl。加药后用无菌透明胶带封窗，放入孵化箱继续孵化。3d后揭去透明胶带，加入适量甲醇、丙酮等量混合固定液，在室温下固定15min。