葡萄糖对人肝细胞血管生成素样蛋白3表达的影响

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1、葡萄糖对人肝细胞血管生成素样蛋白3表达的影响作者：李倩，王继红，程梅，王欣，曾建涛【摘要】目的：观察高浓度葡萄糖对人肝细胞株（L02）及胰岛素抵抗细胞模型（IRL02）的血管生成素样蛋白3（ANGPTL3）表达的影响，探讨ANGPTL3与糖尿病（DM）并发高脂血症的关系，在细胞水平分析DM并发高脂血症的分子机制.方法：以L02为研究对象，并建立胰岛素抵抗模型（IRL02）.L02和IRL02两组细胞分别在含5.6，7.0，11.1，28.0和33.0mmol/L葡萄糖的培养液中培养，5.6mmol/L组作为对照组.用RTPCR方法检测ANGPTL3的mR

2、NA表达量，并用并发高脂血症的关系.结果：高浓度葡萄糖可促进L02和IRL02两组细胞ANGPTL3的mRNA和蛋白质表达，并呈一定的量效关系，变化差异均有统计学意义（P<0.0001）；IRL02细胞对葡萄糖的刺激尤为敏感（P<0.0001）.结论：高浓度葡萄糖可上调ANGPTL3的基因和蛋白质表达，其在DM并发高脂血症中可能起重要作用.【关键词】血管生成素样蛋白3；糖尿病；高脂血症；葡萄糖；胰岛素抗药性0引言人血管生成素样蛋白3（angiopoientinlikeprotEin3，ANGPTL3）是Mr约为70ku的分泌蛋白，由460个氨基

3、酸组成，其氨基端的螺旋样结构域与调节脂质代谢的功能相关，主要在肝脏中表达［1］.ANGPTL3可通过抑制脂蛋白脂肪酶（lipoprotEInlipase，LPL）的活性导致以极低密度脂蛋白（veryloellitus，DM）的发生与发展.血脂异常是DM的危险因素，而有关ANGPTL3与DM相关性的研究目前国内外都极少报道.本实验通过研究高糖环境下人肝细胞株（L02）及其胰岛素抵抗细胞模型（insulinresistantL02，IRL02）ANGPTL3的mRNA和蛋白表达量变化，分析葡萄糖对该基因表达的影响，拟从分子水平探讨ANGPTL3在DM并发高脂血症中

4、的病理生理作用.1材料和方法1.1材料L02（重庆医科大学基础研究所）；RPMI1640培养基，1∶125胰蛋白酶（美国Gibco公司）；胎牛血清（美国Hyclone公司）；RTPCR试剂盒（宝生物大连有限公司）；ANGPTL3基因引物和βActin引物，胰岛素（上海生物工程技术服务有限公司）；ANGPTL3小鼠mAb和βActin小鼠mAb（英国Abcam公司）；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠mAb，PVDF膜（北京鼎国生物制品公司）；免疫印迹（I1640培养液在50mL/LCO2,37℃条件下培养，选取对数生长期的细胞用于实验.用含5×10-7mol/L胰岛

5、素的培养液培养16h的L02细胞代替胰岛素抵抗模型，称为IRL02细胞，以在不含胰岛素的培养液中培养16h的L02细胞为对照.细胞计数,接种后随机分为L02细胞组和IRL02细胞组.其中L02细胞组在上述条件培养16h，更换无血清培养液培养24h后，又分为G1~G5五个亚组，分别用含5.6，7.0，11.1，28.0，33.0mmol/L的葡萄糖培养液培养24h，设G1为对照组.IRL02细胞组：除用含5×10-7mol/L胰岛素的培养液替换胎牛血清培养L02细胞外，其它培养条件和时间与L02细胞组完全相同，同样分为IRG1~G5五个亚组，设IRG1为

6、对照组.1.2.2RTPCR检测ANGPTL3的mRNA表达量按总RNA抽提试剂盒说明操作提取细胞总RNA，用UV法定量分析RNA得率和纯度，琼脂糖凝胶电泳分析其完整性.cDNA合成（10μL反应体系）：取MgCl22μL，10×RT缓冲液1μL，无核酸酶蒸馏水3.75μL，dNTP混合液1μL，RNA酶抑制剂0.25μL，AMV逆转录酶0.5μL，随机引物0.5μL，总RNA(300ng)1μL.逆转录反应条件：30℃10min，42℃30min，99℃5min，5℃5min，所得产物用于PCR扩增.PCR反应：采用PrimerPremier5.0软件设计A

7、NGPTL3引物和βActin引物.ANGPTL3上游引物序列：5′TCCAGAACACCCAGAAGTAAC3′，下游引物序列:5′CCAGCCTCCTGAATAACCCT3′；βActin上游引物序列:5′TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA3′，下游引物序列：5′TCAGGAGGAGCAATGATCTTG3′.ANGPTL3和βActin反应同管进行，终体积50μL.PCR反应条件：94℃2min，1个循环；94℃30s，55℃30s，72℃1min，共35个循环.取8μL反应液进行25g/L琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统采集图片，Quantity

8、One软件分析，将ANG