蒙古沙冬青amdreb2.2基因的克隆与植物表达载体构建

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1、蒙古沙冬青AmDREB2.2基因的克隆与植物表达载体构建张至玮，李章磊，高飞，曹玉震，夏波林，周宜君（中央民族大学生命与环境科学学院，北京１０００８１）摘要：从前期建立的蒙古沙冬青［Ａｍｍｏｐｉｐｔａｎｔｈｕｓｍｏｎｇｏｌｉｃｕｓ（Ｍａsｘｉｍ）Ｃｈｅｎｇｆ．］根转录本数据库中克隆得到１个编码ＤＲＥＢ类转录因子基因。结果表明，ＡｍＤＲＥＢ２．２基因序列全长１０４５ｂｐ，开放阅读框（ＯＲＦ）为５９７ｂｐ，编码１９８个氨基酸，具有典型的ＤＲＥＢ转录因子保守的ＡＰ２结构域。实时荧光定量ＰＣＲ分析表明，该基因能在根、叶中表达，但对干旱、低温响应不同，ＡｍＤＲＥＢ２．２主要参与根的干旱胁迫应

2、答。在ＡｍＤＲＥＢ２．２基因的编码区两端分别加入ＢａｍＨⅠ和ＳａｃⅠ酶切位点，双酶切植物表达载体ｐＰＺＰ２１２和带有酶切位点的ＡｍＤＲＥＢ２．２基因ＰＣＲ产物，成功获得了ＡｍＤＲＥＢ２．２的植物过表达载体ｐＰＺＰ２１２－ＡｍＤＲＥＢ２．２。..关键词：蒙古沙冬青［Ａｍｍｏｐｉｐｔａｎｔｈｕｓｍｏｎｇｏｌｉｃｕｓ（Ｍａsｘｉｍ）Ｃｈｅｎｇｆ．］；ＡｍＤＲＥＢ２．２基因；表达特征；植物表达载体中图分类号：Ｑ７８文献标识码：A：0439－８114（２０15）16－4065-05DOI:10.14088/j.ki.issn0439-8114.2015.16.061收稿日期：２０１４－１２－

3、１７基金项目：国家自然科学基金项目（３１３７０３５６）；中央民族大学“９８５工程”学科建设项目（ＹＬＤＸ０１０１３）；国家大学生创新训练项目（ＧＣＣＸ２０１４１１００２０）；中央民族大学研究生科研创新项目（Ｋ２０１４０４４）简介：张至玮（１９９３－），女，陕西安康人，在读本科生，研究方向为植物抗逆分子生物学，（）１３８０１０４７２２６４（电子信箱）ｚｈｉｗｅｉ＿ｍｕｃ＠１６３．ｃｏｍ；通信，周宜君（１９６４－），女，福建福州人，教授，博士，主要从事植物抗逆分子生物学研究，（电子信箱）ｚｈｏｕｙｉｊｕｎ＠ｍｕｃ．ｅｄｕ．ｃｎ。植物中应答逆境胁迫的基因通常按照功能分为两类，一类是功能基

4、因；另一类是调控基因。转录因子基因作为调控基因的一种，可以与真核基因启动子的顺式作用元件结合，从而达到激活或者抑制转录的目的［１，２］。目前，已经获得了多种转录因子基因，将其应用于植物抗逆基因工程的研究取得了重要进展［３，４］。其中，对ＤＲＥＢ（Ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔｂｉｎｄｉｎｇ）转录因子基因的研究较多［５－７］。ＤＲＥＢ转录因子属于ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）家族成员，受干旱、高盐或低温诱导表达，其氨基酸序列的Ｎ末端具有核定位信号，Ｃ末端具有转录激活结构域，而位于中部的Ａ

5、Ｐ２／ＥＲＥＢＰ结构域非常保守，由５８个氨基酸组成，能形成３个β－折叠和１个α－螺旋，两个结构都可以结合到ＤＲＥ元件的核心结构ＰＵＣＣＧＡＣ上［３，８］。研究表明，ＤＲＥＢ２转录因子基因主要参与调控植物应答干旱、高盐和热激胁迫的基因表达［３，９］。蒙古沙冬青［Ａｍｍｏｐｉｐｔａｎｔｈｕｓｍｏｎｇｏｌｉｃｕｓ（Ｍａsｘｉｍ）Ｃｈｅｎｇｆ．］隶属豆科沙冬青属，为中亚荒漠中的孑遗植物，具有极强的耐旱、耐低温、耐瘠薄等抗逆特性，是集重要科学价值和生态价值于一身的研究材料。近年来，关于蒙古沙冬青的抗逆机理和抗逆基因资源的挖掘受到关注，并取得了重要研究进展［１０－１４］。本研究以蒙古沙冬青为研

6、究材料，基于实验室前期建立的蒙古沙冬青根转录本数据库［１０］，克隆获得１个新的ＤＲＥＢ类转录因子基因，对其结构和逆境表达模式进行了分析，并构建了ＡｍＤＲＥＢ２．２基因的植物表达载体，为进一步通过异源表达验证ＡｍＤＲＥＢ２．２基因的生物学功能奠定了基础。１材料与方法１．１材料１．１．１植物材料蒙古沙冬青种子采自于宁夏回族自治区中卫县。１．１．２菌株和质粒ｐＰＺＰ２１２植物表达载体由中央民族大学生命与环境科学学院植物分子生物学实验室保存、大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＤＨ５α购自北京博迈德科技发展有限公司、ｐＧＥＭ－Ｔ载体购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司。１．１．３酶和试剂Ｔｒｉｚｏ

7、ｌ试剂购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；ＦａｓｔＱｕａｎｔｃＤＮＡ第一链合成试剂盒和ＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ购自天根生化科技（北京）有限公司；胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＳｕｐｅｒｍｉｘ和限制性内切酶均购自Ｔｈｅｒｍｏ公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。１．２方法１．２．１引物设计根据蒙古沙冬青根转录本数据库中获得的ＤＲＥＢ相关基因序列，采用Ｐｒｉｍｅｒ５．０设计引物，引物Ｐ２．２Ｆ－Ａ：５′－ＧＣＡＡＧ