苦参碱对宫颈癌hela细胞的作用

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1、苦参碱对宫颈癌Hela细胞的作用【摘要】　　目的:观察不同浓度的苦参碱对宫颈癌Hela细胞的作用。方法:浓度分别为0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml的苦参碱体外培养Hela细胞24h、48h、72h后，分别用MTT法观察苦参碱对Hela细胞的生长抑制作用、AnnexinV-PI双标染色用流式细胞仪检测苦参碱对Hela细胞凋亡的影响。结果：不同浓度的苦参碱具有抑制宫颈癌Hela细胞增殖的作用，呈明显的时间、剂量依赖性。各浓度和时间之间比较具有显著差异性（P<0.01）。FCM检测结果显示苦参碱作用后，细胞的凋亡率增

2、加，呈现随时间和剂量依赖性。各浓度和时间之间比较也具有显著差异性（P<0.01）。结论：苦参碱对人宫颈癌Hela细胞的增殖具有明显的抑制作用，能诱导肿瘤细胞的凋亡。【关键词】苦参碱;凋亡　　苦参是临床常用的中药之一，是豆科植物苦参SophoraFlavescensAit的干燥根，苦参碱类生物碱是从苦参（sophoraflavescensait）提取的具有广泛药理作用的活性物质［1］。近年研究苦参碱能抑制很多肿瘤的增殖和导致其肿瘤细胞的凋亡，在胃癌细胞SGC7901［2］、口腔上皮癌KB细胞［3］、大肠癌HT29细胞［4］和结肠癌SI1640培

3、养基和胰酶（EDTA），美国Gibco公司产品；新生小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，噻唑蓝(MTT)染液为北京中山公司产品；AnnexinVFITC/PI凋亡检测试剂盒，BenderMedsystem公司产品，晶美生物工程有限公司代理。　　1.2仪器设备　　超净工作台，细胞培养箱（HG3033K）；倒置显微镜OLYMPUS；流式细胞仪（CoulterEpicsXL），酶联免疫监测仪（BioRad550）。　　1.3细胞株　　宫颈癌Hela细胞株由武汉大学医学院病毒研究所伍星欣教授馈赠。　　2方法　　2.1体外细胞培养　　Hela细胞培养

4、于含10％新生小牛血清、100U/ml青霉素、100mg/l链霉素的RPMI1640培养基中，置于5％CO2、37℃、95%饱和湿度的恒温密闭孵箱中进行常规培养，每日观察细胞的生长情况。2～3天传代一次。　　2.2MTT法检测细胞生长抑制率　　取对数生长期的Hela细胞，0.02％EDTA消化、计数，以1×l05个细胞/毫升悬液200ul/孔接种于96孔培养板，24h后加入质量浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0mg/ml经生理盐水稀释的苦参碱（Mat）,对照组仅加生理盐水。孵育24、48、72h后换无血清的培养基加MTT20ul继续培养,4h后弃

5、去培养基，每孔加二甲基亚砜200ul/孔，振荡10min，在全自动酶标仪上选择波长490nm测定吸光值（A值），计算各组细胞的生长抑制率。细胞抑制率=（1-实验组A/对照组A）×100％，计算细胞抑制率。实验重复3次，每次、每浓度、每时段均设6个复孔。　　2.3AnnexinVFITC/PI双标染色，流式细胞仪测定Hela细胞的调亡率　　收集不同浓度（0.5、1.0、1.5、2.0mg/ml）、不同时间（24、48、72h）苦参碱处理后的细胞，EDTA消化，收集1×106细胞，1000r/min离心5min，弃上清，用4℃预冷的PBS洗细胞，1000r/

6、min离心5min弃上清，共两次。用250ul结合缓冲液重新悬浮细胞。取100ul细胞悬浮于5ml流式管中，加入5ulAnnexinV/FITC和10ul20ug/ml的PI，混匀后避光孵育15min，在反应管中加400ulPBS，流式细胞仪（FCM）分析凋亡。　　2.4统计学处理　　数据采用SPSS13.0统计软件分析，采用但因素方差分析进行比较，结果采用±s表示，P<0.05具有统计学意义。　　3结果　　3.1苦参碱对宫颈Hela细胞增殖抑制作用　　苦参碱以时间剂量依赖方式抑制细胞的增殖。0.5、1.0、1.5、2.0mg/ml的苦参碱对细胞均

7、有明显的抑制作用，且随着培养液中苦参碱的浓度增加和培养时间的延长，抑制作用逐渐增强，呈现时间、浓度依赖性。统计学结果显示不同时间之间具有显著差异性（P<0.01），各浓度之间也存在显著差异性（P<0.01）。.L.编辑。　　表1不同浓度苦参碱作用Hela细胞不同时间的吸光度及抑制率（略）　　注：*不同时间比较，P>0.05。　　苦参碱组（0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml）浓度、不同时间（24h、48h、72h）组对宫颈癌细胞的增殖均具有明显的抑制作用(P<0.01),随着浓度的增加，时间的延长

8、，抑制率随之加大，存在浓度、时间的依赖关系。　　3.2AnnexinVPI双标