卡托普利对缺氧复氧乳鼠心室肌细胞atp敏感钾通道含量的影响

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1、卡托普利对缺氧复氧乳鼠心室肌细胞ATP敏感钾通道含量的影响【摘要】目的观察卡托普利晚期预适应对缺氧复氧乳鼠心室肌细胞ATP敏感钾通道含量的影响。方法建立培养乳鼠心室肌细胞缺氧/复氧损伤模型。设正常对照组、缺氧复氧组、缺氧预适应组和卡托普利预适应组。利用激光共聚焦显微镜观察ATP敏感钾通道含量的变化。结果培养的心室肌细胞的Kir6.1及Kir6.2通道蛋白主要在胞浆表达。Kir6.1的含量在缺血再灌注后有所增加，晚期预适应及卡托普利预适应组的Kir6.1的含量大于缺血再灌注组，但Kir6.2的含量在各

2、组均无显著性差异。结论卡托普利晚期预适应作用的发挥与ATP敏感钾通道的蛋白表达增加有关。【关键词】卡托普利；缺氧复氧；ATP敏感钾通道；激光共聚焦显微镜；心室肌细胞研究显示血管紧张素转化酶抑制剂（ACEi）在防治再灌注性心律失常〔1〕，心肌顿抑和心肌坏死〔2〕等方面显示了较好的治疗效果，ACEI预适应的心脏保护作用愈来愈受到重视。ATP敏感钾通道被认为是缺血预适应信号级联反应中的重要效应因子,实验证实ATP敏感钾通道的开放在心脏保护中具有重要作用〔3〕。本实验利用激光共聚焦显微镜研究了在卡托普利晚期

3、缺血预处理过程中ATP敏感钾通道含量的变化，旨在探讨ACEI的晚期缺血预处理作用的离子通道机制。　　1材料与方法　　1.1材料　　IMT2倒置显微镜（OLYMPUS日本），二氧化碳培养箱(RAK日本)。胎牛血清和含各种氨基酸和葡萄糖的（DMEM）合成培养基(Gibco公司)。激光扫描共聚焦显微镜(LSCM,美国Meridian公司)。一抗：兔抗鼠钾通道蛋白（Kir）6.1及Kir6.2多克隆抗体（USA，BD公司）；二抗：荧光标记羊抗兔抗体（IgG/FITC）（美国SantaCruz公司）。　　1.

4、2方法　　1.2.1新生大鼠心肌细胞的原代培养〔4，5〕　　取新生1～4dEM终止胰酶作用，轻吹、混匀后，1000r/min×10min、4℃离心、弃上清，反复3次，以洗去残存胰酶；以差速贴壁法纯化心肌细胞，使纯度达到90%以上。以1.5×106/ml接种于预先用50mg/L多聚赖氨酸涂布过的2.5cm2培养瓶，在37℃、95%O2+5%CO2的二氧化碳孵箱内进行培养。每2日更换一次培养基，取培养4日的单层细胞进行实验。在培养瓶中加入无菌的盖玻片，制备心肌细胞爬片。　　1.2.2爬片鉴定　　采用肌动

5、蛋白单克隆抗体免疫组化染色法，显示心肌细胞纯度达90%以上。　　1.2.3心肌细胞缺氧、复氧及模拟缺血模型的制备〔6〕　　　　参照Koyama等的方法。培养的心肌细胞生长接近融合状态时，弃去培养液，加入缺氧液并向培养瓶中冲入100%氮气，以置换培养瓶中的空气，用胶塞密闭瓶口，即缺血缺氧模型。复氧时，将缺氧液倒掉，加入复氧液并开放培养瓶瓶口，即为复氧模型。　　1.2.4实验分组　　对照组：细胞置于DMEM培养基中于5%CO2、37℃，饱和湿度培养皿中培养；预适应组：细胞于缺氧液、100%氮气，37℃条

6、件下培养5min后，换复氧液，并恢复5%CO2气体环境培养5min，反复循环4次，24h后再于上述缺氧环境中缺氧30min，复氧90min；缺氧复氧组：细胞于上述缺氧环境中缺氧30min，复氧90min；卡托普利预处理组：卡托普利与细胞共同孵育24h后，再行缺氧30min，复氧90min（卡托普利的终浓度为102mol/L）。　　1.2.5爬片制备　　①固定：用多聚甲醛固定20min；②漂洗：以0.01mmol/LPBS（pH7.4）振洗3min，共洗3次；③以0.3%过氧化氢室温处理30min，

7、封闭内源性过氧化物酶的活性；④PBS漂洗2min，共2次；⑤3%正常灭活羊血清室温孵育30min，以阻断组织与抗体的非特异性结合，降低背景染色；⑥轻轻弃去孵育液，不冲洗，滴加第一抗体（1∶30稀释），37℃湿盒内孵育1h，4℃冰箱过夜；⑦PBS充分冲洗5min，共3次，以除去非特异性吸附的抗体；⑧滴加带荧光标记的二抗（1∶50稀释），湿盒内孵育30min，PBS振洗3min，共3次。　　1.2.6LSCM观察　　用无荧光的缓冲甘油封片后直接在LSCM下观察并拍照。用于FITC的激发波长为488nm，

8、共聚焦系统由BioRad公司提供的软件控制,在Penium90计算机中进行，显微镜聚焦旋钮由步进马达控制。用于图像采集的物镜为Planneofluar40×物镜，7%滤光片,进入KiicsImagascan程序,预扫描后选定最佳参数，选定视野扫描并储存所获信息，各组扫描至少6个视野，细胞总数在100个以上。数据采集完成以后，进入KiicsImagaScanAnalysis程序分析和处理各次实验存储数据。　　1.3统计学处理　　数据以x±s表示，两组间比较采用t检