聚乙二醇修饰海葵神经毒素rhk2a的分离与纯化

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1、聚乙二醇修饰海葵神经毒素rhk2a的分离与纯化作者：黄慧,潘育方,郭晓娟,舒雅俊,杨帆【摘要】目的对聚乙二醇化海葵神经毒素(mPEGrhk2a)修饰产物进行分离与纯化。方法将聚乙二醇(PEG)化反应所得混合产物超滤除盐后，采用SP650S强阳离子交换层析柱和CM650S弱阳离子交换层析柱进行分离纯化，收集不同NaCl离子浓度下的梯度洗脱液，经超滤除盐、冷冻干燥、SDSPAGE电泳检测，确定分离纯化mPEGrhk2a的色谱条件。结果在保证mPEGrhk2a稳定性的前提下，随着缓冲液pH值的降低，2种阳离子交换柱与mPEGrh

2、k2a的结合量均增加;在同一pH值下，强阳离子交换柱的结合情况更好。用SP650S强阳离子交换层析柱进行分离纯化时，洗脱液中溶液电导率在5～7ms/cm时,mPEGrhk2a能被洗脱下来，而且盐离子浓度梯度变化越缓，mPEGrhk2a修饰产物各洗脱峰的分离度越高;用CM650S弱阳离子交换层析柱进行分离纯化时，修饰产物mPEGrhk2a主要在穿透峰中出现。结论使用SP650S强阳离子交换层析柱，用pH4.0的0.02mol/L醋酸盐缓冲液与含0.5mol/LNaCl的pH4.0的0.02mol/L醋酸盐缓冲液(后者比例变化为

3、0%→50%)进行梯度洗脱，修饰产物mPEGrhk2a与未修饰的rhk2a得到了很好的分离。【关键词】聚乙二醇化海葵神经毒素;阳离子交换层析;分离;纯化Abstract:ObjectiveToisolateandpurifymPEGrhk2a.MethodsThemixtureobtainedfrompegylatedreactionsnforstrongionexchangeandToyopearlCM650columnforchloride,ultrafiltratedandfreezedried,detectedbySDS

4、PAGEelectrophoresistodeterminechromatographicconditionofisolateandpurifymPEGrhk2a.Results650S弱阳离子交换层析柱料(日本TOSOH公司生产);AmiconTMStirredCell超滤装置、再生纤维素超滤膜(截留分子量1000)(美国Millipore公司);BiologicLP层析系统(美国BioRad公司);BETA18K型冷冻干燥机(德国CHRIST公司);Delta320pH计(梅特勒托利多公司)。　　2实验方法　　将rhk2

5、a按照最佳工艺条件修饰后得到的mPEGrhk2a修饰反应混合物，用截流分子量为1000的超滤膜超滤除盐，然后用被缓冲溶液平衡后的阳离子层析柱进行分离纯化[3,4]，考察不同盐离子浓度缓冲液的分离效果，收集各洗脱峰的流出液，将收集液超滤除盐后，转入50mL离心管中，于-80℃下预冻3～4h，在-35～-20℃下抽真空冷冻干燥24h，所得产物用TrisTricine系统进行SDSPAGE电泳检测。　2.1平衡、洗脱缓冲液pH值的选择　　2.1.1SP650S强阳离子交换层析柱平衡、洗脱缓冲液pH值的选择取试管7支，各加1gSP65

6、0S强阳离子交换层析柱料后，分别用纯水洗涤，每次10mL，洗5次。考虑到mPEGrhk2a的稳定性[5,6]，各加入pH值分别为4.0、4.6、5.0、5.4的醋酸钠醋酸缓冲液与pH值分别为6.0、6.5、7.0的磷酸钠磷酸缓冲液淋洗，每次10mL，洗5次，待柱料平衡稳定，在每管中加入2mg的mPEGrhk2a，摇动试管5～15min，静置待柱料下沉，取每管上清液于280nm下测定其紫外吸收值。　　2.1.2CM650S弱阳离子交换层析柱平衡、洗脱缓冲液pH值的选择取试管7支，各加1gCM650S弱阳离子交换层析柱料后，余下

7、操作同“2.1.1”。　　2.22种离子交换层析柱分离纯化修饰产物的条件　　SP650S强阳离子交换层析柱的规格为2.6cm×4cm(柱容量1CV=25mL)，柱平衡液为3CV的pH4.0的0.02mol/L醋酸盐缓冲液，流速为1mL/min，检测波长为280nm，色谱柱清洗液为5CV的0.5mol/LNaOH溶液。CM650S弱阳离子交换层析法的色谱条件同上。　　SP650S强阳离子交换层析法用于梯度洗脱的缓冲液见表1;CM650S弱阳离子交换层析法依次更换的洗脱液为NaCl含量分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1

8、mol/L的pH4.0的0.02mol/L醋酸盐缓冲液各5CV。　　3结果　　3.1SP650S强阳离子交换层析和CM650S弱阳离子交换层析洗脱条件的选择与比较表1SP650S强阳离子交换层析法所用