表皮生长因子受体特异性单链抗体的筛选及初步鉴定

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1、表皮生长因子受体特异性单链抗体的筛选及初步鉴定作者：赵晓蓉，戴文涛，王敏，彭吉林，黄韬，王国斌，伍钢，沈关心【摘要】目的从大型人源抗体库Griffin1中直接筛选出靶向EGFR的单链抗体。方法以稳定转染的CHOEGFRGFP1细胞和未转染的CHOK1细胞分别作为EGFR阳性和阴性细胞，采用负筛选的方法进行筛选；通过比较每轮投入及洗脱出噬菌体的效价比以及细胞ELISA检测多克隆pscFv与阳性、阴性细胞结合情况对筛选过程进行监测；采用菌落PCR挑选含有全长scFv片断的菌落，进一步用细胞ELISA检测单克隆pscFv与EGFR阳性及阴性细胞

2、结合特异性；挑选EGFR特异性单克隆pscFv采用DNA测序法确定克隆多样性。结果经过5轮筛选，细胞裂解液中洗脱出噬菌体效价有500倍以上增长；细胞ELISA结果显示多克隆pscFv与CHOEGFRGFP1细胞和CHOK1细胞均有明显结合，但有部分特异性结合EGFR；菌落PCR显示约45％克隆中含有完整的1kbscFv片断；经细胞ELISA、DNA测序检测共获得1株EGFR特异性单链抗体，命名为F4scFv。结论F4scFv可与筛选中所用EGFR阳性细胞特异性结合，为进一步研制以此单链抗体为靶向分子的抗肿瘤药物奠定了基础。【关键词】表

3、皮生长因子受体；抗体库；单链抗体；肿瘤靶向　　Abstract:ObjectiveToSelectanepidermalgroalargenonimmunephagedisplaylibrary.MethodsCHOEGFRGFP1,atransfectedcelllineexpressingEGFRGFPfusionprotEinonmembrane,andtheuntransfectedcelllineCHOK1onitoredbyparingthenumberofphagerecoveredfromtheacidelutionandc

4、elllysateineachround，andbytestingEGFRbindingspecificityofpolyclonalphagescFv(pscFv)onCHOEGFRGFP1andCHOK1cellineEGFRbindingspecificityofmonoclonalpscFvonEGFRpositiveandnegativecell.ThenumberofindividualEGFRbindingclonesinedentsthethirdtothefifthroundofselectiononCHOEGFR

5、GFP1andCHOK1cell,butapartofpolyclonalscFvboundEGFRspecially.About45%oftheselectedclonescontainedafullsizedinsertof1kb.OneuniquehumanantiEGFRscFv(F4scFv)entforfurtherdevelopingofantitumordrugsusingthisscFvastargetmolecule.　　Keyortargeting　　利用抗体将治疗分子（毒素、治疗基因）直接运送到肿瘤细胞内发挥作用

6、是一种重要的肿瘤靶向治疗策略［1］。表皮生长因子受体（epidermalgroent，scFv），为研究靶向EGFR的抗肿瘤治疗药物奠定基础。　　1材料与方法　　1.1材料　　　　中国仓鼠卵巢细胞CHOK1以及稳定转染细胞系CHOEGFRGFP1［将含有全长EGFRcDNA的载体pEGFREGFP（由德国哥廷根MaxPlanck研究院ThomasM.Jovin教授惠赠）转染CHOK1细胞而获得［2］］由华中科技大学免疫学系保存，培养于含10％（φ）小牛血清的RPMI1640培养基中。　　　　Griffin1抗体库由英国剑桥大学蛋白质工程中

7、心Greg13mAb(Amersham)，辣根过氧化物酶(HRP)标记的rabbitantimouseIgG(KPL)。　　1.2方法　　1.2.1EGFR特异性单链抗体的筛选CHOEGFRGFP1于75mL细胞培养瓶中培养至80%～90%饱和。1mL噬菌体抗体库（1×1012cfu，溶于3mL完全培养基中）首先与5×106CHOK1细胞4℃孵育1h，离心收集抗体库再与CHOEGFRGFP1细胞4℃孵育1h。细胞用4℃完全培养基洗6次，然后加入37℃预温的完全培养基于37℃、5%CO2培养箱孵育30min。细胞膜表面结合的噬菌体用冷的

8、甘氨酸缓冲液（500mmol/LNaCl,0.1mol/Lglycine,pH2.5）4℃洗脱3次，每次10min，然后用