外阴阴道假丝酵母菌病患者阴道局部甘露糖结合凝集素

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1、外阴阴道假丝酵母菌病患者阴道局部甘露糖结合凝集素【摘要】目的：初步探讨甘露糖结合凝集素（MBL）在外阴阴道念珠菌病（VVC）和复发性外阴阴道念珠菌病（RVVC）发病过程中的免疫机制。方法：选取2006年1月～2007年7月健康体检的女性、VVC患者、RVVC患者各20例，采集阴道灌洗液，半定量RT-PCR测定MBL-mRNA表达情况。结果：阴道局部MBL-mRNA的表达VVC患者显著高于正常人群，而RVVC患者显著低于正常人群。结论：VVC患者阴道局部MBL-mRNA高表达说明MBL参与了局部免疫反应，其在免疫防御中发挥了重要

2、作用，而阴道局部MBL-mRNA的低表达可能和RVVC反复发作不易治疗有关，提示有必要对MBL水平低下者进行MBL临床治疗的研究。【关键词】外阴阴道念珠菌病；甘露糖结合凝集素；阴道灌洗液；mRNA外阴阴道假丝酵母菌病（vulvovaginalcandidiasis,VVC）也称外阴阴道念珠菌病，是一种常见的阴道黏膜真菌感染性疾病，75％的妇女一生中至少患1次VVC，临床上将每年发作VVC≥4次称为复发性外阴阴道念珠菌病（recurrentvulvovaginalcandidiasis，RVVC）。对于VVC发病的免疫机制研究国

3、内外报道甚少,且大部分研究只停留在动物实验阶段。本研究通过测定VVC患者阴道局部甘露糖结合凝集素（MBL）mRNA水平并与健康女性对照，探讨天然免疫在本病发病机制中的地位，以期为本病的免疫治疗提供理论依据。1对象与方法1.1研究对象选取2006年1月～2007年7月在我院门诊健康体检女性，就诊的VVC、RVVC患者各20例，月经周期均规律，3组间各时相分布比较无显著差异。6个月内未服用甾体类激素，1周内无性生活及阴道冲洗。均排除妊娠、糖尿病和长期口服抗生素等易感因素。正常对照组：妇科门诊进行健康体检的女性。妇科检查无异常，阴道

4、分泌物检查无异常。VVC组：检查见典型豆渣样分泌物，镜检见真菌菌丝及孢子，无其它病原菌混合感染，符合VVC诊断标准［1］。RVVC组：妇科门诊检查符合RVVC诊断标准［1］，即VVC经抗真菌治疗后症状、体征消失，真菌学检查阴性，再次发生VVC者称为复发。真菌培养为白色念珠菌，无混合感染。1.2标本的采集研究对象取妇科检查体位，暴露阴道后擦去分泌物，用5ml灭菌生理盐水冲洗宫颈及阴道上端，吸出灌洗液4～5ml收集于专用试管，1000r·min-1离心10min，细胞成分置于EP管中-20℃冻存待测。1.3半定量RT-PCR测定M

5、BL-mRNA1.3.1MBL基因特异性引物的设计与合成根据GenBankMBL基因cds序列，引物由上海生物工程有限公司设计，上游引物为5′-AGGCATCAACGGCTTCCC-3′,下游引物为5′-CCAGGCTACTATCACCATCC-3′;另外设计1对片段长度为270bp的β-actin基因引物,上游引物为5′-CTACAATGAGCTGCGTGTGGC-3′,下游引物为5′-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC-3′。1.3.2阴道灌洗液离心细胞成分总RNA的提取按照Trizol说明书操作，提取的总RNA溶

6、于去焦碳酸二乙酯(DEPC)水中，测OD值，调RNA浓度为1μg·μl-1，分装，然后-70℃冻存待用。1.3.3RT-PCR反应体系取1μlRNA，55～60℃孵育10min以消除RNA二级结构,在冰盒上依次加入10×RT-Buffer2μl、25mmol·L-1MgCl24μl、10mmol·L-1dNTP混合物2μl、Rnase抑制物0.5μl、去DEPC水8.5μl、OligodT1μl、AMV逆转录酶1μl,总反应体积20μl；42℃30min,99℃5min,5℃5min;-20℃冻存。1.3.4PCR反应(1)2

7、5μlPCR反应体系组成如下:5×RT-Buffer5μl、25mmol·L-1MgCl20.5μl、上游引物(25pmol·L-1)1.0μl、下游引物(25pmol·L-1)1.0μl、Taq酶(5U·μl-1)0.25μl、cDNA模板5μl、灭菌水12.25μl。(2)PCR扩增条件:94℃2min,94℃30s,60℃30s,72℃1min,30个循环,72℃7min。然后1％琼脂糖电泳，ImageMasterVDS扫描仪观察电泳条带，拍照，ImageMsaterTotalLab软件分析图像。以β-actin作为内参

8、分别计算MBL产物与β-actin产物OD积分的比值，观察MBL的表达水平。1.4统计学分析所得数据采用SPSS13.0统计软件包进行统计学处理。计量资料用x-±s表示，总体进行方差分析，组间比较用LSD法。2结果2.1一般情况正常对照组20例，年龄(31.85±5.65)岁