环巴胺对胃癌细胞bgc

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1、环巴胺对胃癌细胞BGC作者：任雪萍，姜藻，刘飞，顾晓怡，高峰【摘要】目的:探讨环巴胺对胃癌细胞BGC-823增殖凋亡及Shh、Gli-1基因表达的影响。方法:采用MTT法检测环巴胺对BGC-823细胞的生长抑制效应,倒置显微镜及AO/EB荧光显微镜观察细胞凋亡的形态学改变,流式细胞术检测细胞凋亡率,RT-PCR检测Shh、Gli-1mRNA的表达情况。结果:环巴胺可明显抑制BGC-823细胞的生长,呈时间剂量依赖性，并出现典型的细胞形态学改变；经32、64、96μmol·L－1的环巴胺作用24h后的凋亡率依次为12.50%、31.50%、56.10%，明显高于空白对照组

2、的2.10%(均P<0.01)；Shh及Gli-1mRNA均表达，环巴胺可下调Gli-1mRNA表达，但对ShhmRNA表达无明显影响。结论:环巴胺可以抑制胃癌细胞BGC-823增殖并诱导细胞凋亡，其机制可能与下调Gli-1基因表达有关。【关键词】环巴胺；胃癌细胞；细胞凋亡；Shh；Gli-1；基因表达环巴胺(cyclopamine)是从藜芦属植物内分离得到的一种异甾体类生物碱，因其致畸作用而于20世纪60年代被发现。1998年，环巴胺作为一种Hedgehog信号通路的阻断剂在果蝇体中得到证实［1］。最近研究发现,Hedgehog信号通路的异常激活可能与胃癌的发生

3、发展有关［2］。目前国内外关于环巴胺与胃癌的关系研究较少。本实验旨在研究环巴胺对胃癌细胞系BGC-823的体外生长抑制及诱导凋亡作用，并进一步探讨其可能的作用机制。1材料和方法1.1材料人胃癌细胞系BGC-823由解放军第八一医院全军肿瘤中心惠赠，环巴胺购自Biomol公司，RPMI1640细胞培养基、胎牛血清购自Gibco公司，胰蛋白酶、MTT、DMSO、AO/BE试剂盒购自Sigma公司，AnnexinⅤ-FITC/PI试剂盒购自BD公司，β-actin及Shh、Gli-1基因引物由Invitrogen公司合成，RT-PCR试剂盒购自TaKaRa公司；酶标仪为BIO

4、RED550型，流式细胞仪为美国BD公司FACSCalibur型。1.2方法1.2.1细胞培养BGC-823细胞加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，每3～4d传代1次。1.2.2MTT法检测细胞生长抑制效应取对数生长期细胞接种于96孔板，每孔1×104个细胞,孵育过夜后，加入终浓度为2.5、5、10、20、40、60、80、100μmol·L－1的环巴胺，另设空白调零组、阴性对照组，每组设3个复孔，分别培养24、48、72h，用MTT法测每孔光密度值(OD570值)。抑制率=(1-药物组平均OD570值/对照组平均

5、OD570值)×100%［3］。1.2.3倒置显微镜观察上述各组细胞于倒置显微镜下直接观察细胞形态学变化。1.2.4AO/EB染色荧光显微镜观察收集环巴胺作用24h的细胞及空白对照组细胞，制成浓度为1×107ml－1细胞悬液，取200μl细胞悬液加8μlAO/EB染液混匀，吸10μl混合液点于洁净载玻片上，盖玻片封片后，于荧光显微镜下观察，按试剂盒说明书进行结果判断。1.2.5AnnexinⅤ/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率收集经32、64、96μmol·L－1环巴胺作用24h的细胞及空白对照组细胞，用PBS洗涤2次,采用AnnexinⅤ和PI荧光染色流式细胞术定量分

6、析细胞凋亡率。1.2.6RT-PCR法检测Shh、Gli-1mRNA表达收集各组细胞，Trizol法提取总RNA，按TaKaRa两步法试剂盒提供的说明书进行RT-PCR操作。Shh：上游引物为5′-GCGACTTCCTCACTTTCCTG-3′,下游引物为5′-CCGGTTGATGAGAATGGTG-3′；Gli-1：上游引物为5′-AGGAGTTCGTGTGCCACTG-3′，下游引物为5′-GGCATTGCTGAAGGCTTTAC-3′；内参为β-actin。RT-PCR产物行琼脂糖凝胶电泳，数字成像系统拍照分析。1.3统计学处理实验所得数据以x-±s表示，利用SP

7、SS13.0软件处理包进行统计分析。多组间的比较采用单因素方差分析；采用Probit回归分析计算半数抑制浓度（IC50），检验水准α=0.05。2结果2.1环巴胺对BGC-823细胞的生长抑制效应MTT法检测结果显示，2.5～100μmol·L－1的环巴胺对BGC-823细胞有生长抑制作用，呈时间剂量依赖性（见图1），各组之间的差异有统计学意义(P<0.05)。24、48、72h的IC50依次为64.87、51.23、38.65μmol·L－1。2.2倒置显微镜下细胞形态学变化正常的BGC-823细胞生长良好，细胞贴壁生长，呈圆梭形