mtor信号通路中上游调控蛋白rheb%26fkbp38在脂肪细胞分化中作用 (1)

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1、mToR信号通路中上游调控蛋白Rheb和FKBP38在脂肪细胞分化中的作用摘要I洫eb(Ihshomologe嘶chedinbrain)是小G蛋白I己嬲的同源蛋白，在功能上具有相似性，即具有GTP酶的活性。Rheb在体内有两种存在方式，与GDP结合的方式(GDP．Rjleb)和与GTP结合的方式(GTP．Rheb)，后者才具有相应的生物学活性。Rheb可以通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalianta略etofrap锄ycin，mToR)来调控多种生物学活动，比如存活、生长、增殖、再生、能量代谢、氧化应激等。然而最近有研究报道称，mTOR被过度激活后，可以抑制脂肪分解

2、、促进脂肪生成和储存，而抑制mToR活性后，可以明显减低体脂含量并抵抗高脂饮食诱导的肥胖。因为Rheb是mToR上游的调节蛋白，并且通过mToR来实现其功能，所以我们想阐明在mTOR调节脂肪生成的过程中，I洫eb是否也同样起到了调节作用。为此我们构建了l地eb的重组质粒(pCAG—Insulato卜Rheb)，并将其注射到B6小鼠的胚胎内，产生全身高表达IUeb的转基因小鼠。然后提取转基因阳性小鼠的胚胎成纤维细胞(mouseemb巧011icfibroblaStcells，MEFs)，进行诱导分化。然后通过检测MEFs内甘油三酯的含量、检测脂肪细胞特异性转录因子PPAIⅥ

3、和C／EBPa的表达情况，来观察Rheb在脂肪细胞分化过程中的作用。在本实验中，我们观察到高表达I龇b后，可以促进MEFs内脂滴的生成，甘油三酯含量明显增高，油红O染色(oilRedOStain)有明显区别，并且脂肪细胞特异性转录因子PPAIⅥ和C／EBPa的表达量均明显升高。由此，我们得出结论：I让eb过表达以后确实可以促进脂肪细胞的分化。而Rheb促进脂肪细胞分化的作用也很可能是通过过度激活mTOR来实现的，进一步观察mTOR下游的靶蛋白如S6K、S6的磷酸化表达水平可能为这一现象提供合理的解释。该实验为进一步阐明脂肪细胞分化的调控机制提供新的理论，同时给临床防治肥胖

4、带来新的契机。在体内，FKBP38可以与mTOR直接结合起到抑制mTOR活性的作用，这个效果类似于R丑p锄ycin．FKBPl2复合物的作用，因此FKBP38被认为是mTOR的内源性抑制剂，其活性不需要辅助条件的参与。然而，FKBP38又同时能与GTP—Rheb结合，从而释放其对mTOR的抑制作用。但是对于FKBP38对mTOR的调控作用，目前并没有达到统一的认识，甚至得出了相反的结论。氨基酸作为经典的mTOR激活剂，似乎并没有参与FKBP38对mToR活性的调节。但由于在mToR信号通路中，FKBP38所在的位置特殊，在Rheb的下游、mToR的上游，因此进一步了解FK

5、BP38的生理功能也具有极为重要的意义。为此我们同样构建了FKBP38的重组质粒(pCAG．Insulator-FKBP38)，并注射进B6小鼠胚胎产生全身高表达FKBP38的小鼠，进行成脂诱导分化，观察其在脂肪分化中所具有的调控作用。结果，与l地eb促进脂肪分化的效应相反，FKBP38过表达可以抑制脂肪细胞的分化。但其具体的调控机制第二军医大学硕士学位论文还有待进一步实验证明。目的：(1)观察mTOR信号通路中上游调控蛋白I№b对脂肪细胞分化的影响(2)观察mToR信号通路中上游调控蛋白FKBP38对脂肪细胞分化的影响方法：(1)构建Rheb和FKBP38重组质粒并进行

6、胚胎注射产生全身高表达的转基因小鼠。(2)用聚合酶链反应(PCR)和蛋白免疫印迹(WbStemB10t)法鉴定转基因小鼠的阴阳性和l地eb／FKBP38表达量高低。(3)提取转基因小鼠第13．5天胚胎成纤维细胞(MEFs)进行诱导分化。(4)在分化第12天进行油红O染色(OilI溯O)，并测定细胞内甘油三酯的含量，再用实时定量PCR(RealTime．PCR)方法检测脂肪细胞特异性转录因子PPARY和C／EBPQ的表达情况。结果：(1)高表达I№b后，可以促进MEFs内脂滴的生成，甘油三酯含量明显增高(P<0．05)，油红O染色(OilRedOStain)有明显区别，并且

7、脂肪细胞特异性转录因子PPAIh和C／EBPa的表达量均明显升高(P