罗丹明123分离的肝癌细胞系mhcc97亚群af

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1、罗丹明123分离的肝癌细胞系MHCC97亚群AF【摘要】　　目的:应用罗丹明123（Rho123）结合流式细胞术（FCM）对人肝癌细胞MHCC97进行分选,检测甲胎蛋白(AFP)在不同肝癌细胞亚群中的表达差异。方法:应用罗丹明123（Rho123）结合FCM将人肝癌细胞株MHCC97分为Rholoa公司产品;小鼠抗人AFP单克隆抗体（mAb）、羊抗小鼠IgG二抗免疫组化及DAB显色试剂盒为北京中杉公司产品;DEPC水为Sigma公司产品;Rnase抑制剂、随机引物及MMLV逆转录酶为Promega公司产品;AFP引物为北京三博远志生物

2、技术公司产品;琼脂糖、TaqDNA聚合酶、FACSAria流式细胞分选仪为美国BD公司产品;BX51荧光显微镜及DP70数字图像摄影系统为Olympus公司产品;FR980A生物凝胶电泳图象分析系统为复日公司产品。　　1.2方法　　1.2.1不同浓度Rho123染色的Rholog/L),分别做0.1mg/L和0.05mg/L2个浓度梯度,对照组加入维拉帕米（终浓度50mmol/L）,以未加Rho123作为阴性对照,37℃避光水浴30min,冰上5min终止染色,冰预冷HBSS洗涤细胞并重悬。480nm激发光源,检测FITC通道,对

3、数模式采集信号做一维散点图,将低Rho123且维拉帕米组缺失的区域设定为Rholomol/L,37℃避光水浴30min,冰上5min终止染色,冰预冷HBSS洗涤细胞并重悬。②FCM检测分选:480nm激发光源检测,对数模式采集信号做一维散点图,将低Rho123且维拉帕米组缺失的区域设定为RholoAb工作浓度1∶100,DAB显色,苏木精复染。以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。胞质出现棕黄色颗粒定为阳性,根据阳性细胞百分率分为:阳性细胞<10%为(-),阳性细胞10%～25%为(+),26%～50%为(++),>50%为(

4、+++)。　　1.2.4统计学处理SPSS10.0统计软件包分析,采用非参Manng/L组单纯加入Rho123组几乎无低荧光拖尾,加入维拉帕米无明显改就;0.1mg/L组有一低荧光拖尾,而维拉帕米拮抗组此区有改变;0.05mg/L组同样有一低荧光拖尾,而维拉帕米拮抗组此区有明显改变,该区比例为2.1%,分别选取此浓度作为分选浓度(图1)。　　图1Rholog/L染色;c:Rho1230.1mg/L＋维拉帕米;d:Rho1230.05mg/L;e:Rho1230.05mg/L＋维拉帕米.　　2.2Rholo分析（略）　　2.3Rholo

5、w及Rhohigh亚群的AFP免疫细胞化学比较2组细胞内均有阳性表达,阳性反应为显示位于细胞质的棕黄色颗粒,共计数Rholow的肝癌细胞37个,(-)为3个,(+)为5个,(++)为21个,(+++)为9个;Rhohigh的肝癌细胞29个,(-)为5个,(+)为16个,(++)为6个,(+++)为2个,比较有统计学意义（P<0.01）。　　3讨论　　原发性肝细胞癌是我国常见恶性肿瘤之一,死亡率居世界之首（占40%）,因此,对肝癌的防治是重点[2]。癌发病机制的研究表明,肝脏中具有肝祖细胞特征的卵圆细胞参与了肝癌的发生;肝癌组织的异

6、质性表明,并不是每个肝癌细胞都具有行成肿瘤的能力,肝癌细胞之间在耐药性上也有巨大的差异,这提示肝癌组织中可能存在有具有表型和功能特殊的肝癌细胞[1],分离和鉴定这群细胞是否具有干细胞特征对阐明肝癌发病机制、揭示肝癌复发和转移的机制具有重要的意义,并为治疗肝癌提供一个新的策略。　　造血干/祖细胞具有将荧光染料Hoechst33342或Rho123泵出细胞外的特性,利用这一特性并结合FCM可对其进行分离纯化[2]。Rho123/FCM的基本原理是利用了干细胞对染料具有排斥性这一特异性功能标志,干细胞能通过细胞表面的P糖蛋白将进入胞内的Rho

7、123主动外泵至胞外,表现为低荧光的特征,可分选为RholoRNA检测阴性的患者中,第1年和第3年的存活率分别为96.6%和91.4%;而阳性的患者,存活率分别为86.2%和55.5%。　　肝癌细胞分化程度越低,合成的AFP越多,AFP表达水平从一定程度上可判断肝癌细胞的分化程度[7]。AFP表达在2个亚群中有明显差异,且强阳性主要分布在Rholohepatocellularcarcinomacellsharborscancerstemcelllikeproperties[J].Hepatol,2006,44(1):240-251.　

8、　[4]Yulin3rd,ParkerM,etal.IsolationandenrichmentofmurinespermatogonialstemcellsusingRodamine123mitochon