浅析罗丹明123分离的肝癌细胞系MHCC97亚群AFP的表达

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1、浅析罗丹明123分离的肝癌细胞系MHCC97亚群AFP的表达【摘要】　　目的:应用罗丹明123结合流式细胞术对人肝癌细胞MHCC97进行分选,检测甲胎蛋白(AFP)在不同肝癌细胞亚群中的表达差异。方法:应用罗丹明123结合FCM将人肝癌细胞株MHCC97分为Rholow和Rhohigh组,采用免疫细胞化学方法观察AFP表达和含量。结果:Rholow组和Rhohigh组比较,AFP表达率有显著性差异。结论:AFP在肝癌细胞亚群中表达有差异,Rho123结合FCM可以进一步证实肿瘤的异质性。【关键词】肝细胞癌异质性罗丹明123恶性肿瘤虽然是从一个发生恶性转化的细胞

2、单克隆增殖而来的,但在生长过程中,可能出现其生长速度、侵袭能力、对生长信号的反应、对抗癌药物的敏感性等方面的差异,而这种异质性的特点正是恶性肿瘤容易复发及产生耐药性的根本原因[1]。瘤细胞异质性及其所导致的肿瘤细胞的生物学行为的改变,对了解肿瘤细胞的生物学特性和指导临床有重要意义。近年来,利用流式细胞术检测可以获得组织中具有原始干细胞特征的成体细胞,利用类似的方法可以将肝癌细胞分成2个不同特性的亚群,从而获得具有原始干细胞特性的成体细胞。甲胎蛋白(AFP)是肝癌特异性最强的标记物,但是也存在异质性,临床上常遇到良性肝病的AFP值明显增高或是原发性肝癌AFP值偏

3、低。AFP在肝癌组织中的差异表达有可能反映了肝癌组织中不同癌细胞在分化程度上的差异。我们应用罗丹明123结合FCM对肝癌细胞系MHCC97分选为Rholow细胞及Rhohigh亚群,并对各亚群对AFP进行差异性比较。　1材料和方法材料MHCC97肝癌细胞(人高转移肝癌细胞系)由上海复旦大学中山医院肝癌研究所提供;DMEM培养基、.5g/L胰酶为Gibco公司产品;小牛血清为四季青公司产品;Rho123为Sigma公司产品;小鼠抗人AFP单克隆抗体、羊抗小鼠IgG二抗免疫组化及DAB显色试剂盒为北京中杉公司产品;DEPC水为Sigma公司产品;Rnase抑制剂、

4、随机引物及MMLV逆转录酶为Promega公司产品;AFP引物为北京三博远志生物技术公司产品;琼脂糖、TaqDNA聚合酶、FACSAria流式细胞分选仪为美国BD公司产品;BX51荧光显微镜及DP70数字图像摄影系统为Olympus公司产品;FR980A生物凝胶电泳图象分析系统为复日公司产品。方法不同浓度Rho123染色的Rholow及Rhohigh细胞的分析MHCC97细胞常规消化,HBSS洗涤,制备成单细胞悬液,细胞密度为1×105/L。等分细胞悬液,参考Rho123对线粒体膜电位测定的浓度(mg/L),分别做mg/L和/L2个浓度梯度,对照组加入

5、维拉帕米,以未加Rho123作为阴性对照,7℃避光水浴30min,冰上min终止染色,冰预冷HBSS洗涤细胞并重悬。480nm激发光源,检测FITC通道,对数模式采集信号做一维散点图,将低Rho123且维拉帕米组缺失的区域设定为Rholow细胞的“门”。Rholow及Rhohigh细胞的分选①细胞染色:MHCC97细胞常规消化,HBSS洗涤,制备成单细胞悬液,细胞密度为1×106/L。等分细胞悬液,组均加入荧光染料Rho123根据上一步结果选择合适终浓度,其中1组再加入维拉帕米,终浓度50mmol/L,7℃避光水浴30min,冰上min终止染色,冰预冷HBSS

6、洗涤细胞并重悬。②FCM检测分选:80nm激发光源检测,对数模式采集信号做一维散点图,将低Rho123且维拉帕米组缺失的区域设定为Rholow细胞的“门”,计算百分比,分选出Rholow细胞及Rhohigh细胞。AFP免疫细胞化学分析采用SP方法,操作步骤参照SP试剂盒说明。AFPmAb工作浓度1∶100,DAB显色,苏木精复染。以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。胞质出现棕黄色颗粒定为阳性,根据阳性细胞百分率分为:阳性细胞50%为(+++)。统计学处理统计软件包分析,采用非参MannWhitney两独立样本秩和检验。　2结果.1Rholow及Rhohigh

7、细胞的分析1mg/L和/L组单纯加入Rho123组几乎无低荧光拖尾,加入维拉帕米无明显改就;mg/L组有一低荧光拖尾,而维拉帕米拮抗组此区有改变;/L组同样有一低荧光拖尾,而维拉帕米拮抗组此区有明显改变,该区比例为%,分别选取此浓度作为分选浓度(图1)。图1Rholow及Rhohigh细胞分析的FCM分析a:阴性对照;b:mg/L染色;c:mg/L＋维拉帕米;d:/L;e:/L＋维拉帕米..2Rholow及Rhohigh细胞的分选受检细胞大小、形态、细胞质均一性一致,无PI染色细胞,无杂细胞干扰。单纯加入Rho123组有一低荧光拖尾,而维拉帕米拮抗组无此区域,

8、即Rholow细胞,占总数的%(图2)