肝癌细胞系mhcc97亚群中甲胎蛋白的表达差异

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1、肝癌细胞系MHCC97亚群中甲胎蛋白的表达差异作者：张宁，窦科峰，李韧，樊菁，张福琴【关键词】,肝细胞癌；甲胎蛋白；边缘群；异质性【Abstract】AIM:ToexploretheexpressioncharacteristicsofalphafetoprotEin(AFP)indifferentsubpopulationsofMHCC97celllinesofhumanhepatocellularcarcinoma(HCC).METHODS:Sidepopulation(SP)cellsan

2、dnonSPcellsmunocytochemicalstainingedtoshouchmoreexpressedinSPcellsthaninnonSPcells.CONCLUSION:ThedifferentialexpressionofAFPcanbeseeninMHCC97celllines，andmostAFPpositivecellsarefromSPcells,indicatingHCCisheterogeneous.【Keya；alphafetoprotEIn；sidepopu

3、lation；heterogeneity【摘要】目的：探讨甲胎蛋白（AFP）在不同肝癌细胞亚群中的表达差异.方法：应用流式细胞荧光激活分选法将肝癌细胞分成边缘群（SP）及非边缘群(NonSP)2个细胞亚群，采用免疫细胞化学方法观察AFP在2个不同肝癌亚群中的表达变化及含量.结果：SP细胞仅占细胞总体的1.8%，SP细胞AFP表达明显高于NonSP细胞（P<0.01）.结论：AFP在肝癌细胞中表达有差异，强阳性多数分布在SP细胞亚群中，进一步证实了肿瘤的异质性.【关键词】肝细胞癌；甲胎蛋白；

4、边缘群；异质性0引言病理学很早就证实，AFP在肝癌组织中的表达具有显著的异质性（heterogeneity），但对AFP这种异质性的分布规律及意义存在较大的争议.AFP在肝癌组织中的差异表达有可能反映了肝癌组织中不同癌细胞在分化程度上的差异.近年来，利用流式细胞荧光激活分选法可以获得组织中具有原始干细胞特征的成体细胞［1-2］，利用类似的方法可以将肝癌细胞分成两个不同特征的亚群［3］，因此，探讨AFP在这两个不同亚群肝癌细胞中的表达差异对阐明和验证肝癌组织中是否存在具有干细胞特征的肿瘤细胞具有重

5、要的意义.1材料和方法1.1材料MHCC97细胞系(人高转移肝癌细胞系)购自上海复旦大学中山医院肝癌研究所.免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒（中杉金桥）、FACSAdvantageII型六色荧光流式细胞仪（美国BD公司）、BX51免疫荧光显微镜及DP70数字图像摄影系统（Olympus公司）.1.2方法1.2.1边缘群(SP)细胞及非边缘群(NonSP)细胞的检测①细胞染色：MHCC97细胞常规消化，HBSS洗涤，制备成单细胞悬液，细胞密度为1×109/L.等分细胞悬液，两组均加入荧光染料Hoe

6、chst33342使终浓度为6mg/L，其中一组再加入维拉帕米，终浓度50mmol/L.37℃避光水浴90min，冰上10min终止染色，冰预冷HBSS洗涤细胞并重悬浮.再加入PI使终浓度为2mg/L.②流式细胞仪检测：355nmUV激发光源，610nm双色短通反射滤镜，450nm和675nm边缘长通滤片分别检测散射光蓝光及红光部分，线性模式采集信号.测量前向散射和侧向散射二维参数图，检测细胞均一性，以Hoechstred为X轴，Hoechstblue为Y轴作二维散点图，将低Hoechstred

7、及低Hoechstblue且维拉帕米组缺失的区域设定为SP细胞的“门”（gate），计算百分比.分选出SP细胞及NonSP细胞.1.2.2AFP免疫细胞化学分析将SP细胞及NonSP细胞分别接种于盖玻片，50mL/LCO2孵箱37℃4h，40g/L多聚甲醛常规固定.免疫细胞化学采用SP法，操作步骤参照试剂盒说明书.AFP单抗最适工作浓度1∶100，DAB显色，胞质见棕黄色颗粒为阳性，PBS代替一抗作为阴性对照.在20倍光镜视野下各选取3个细胞最为密集的区域，应用ProPlus软件分析各组细胞的A

8、值，将A值划分等级并分别计数，<0.18为“-”，0.18～0.5为“+”，0.5～1.0为“”,>1.0为“”.比较两组细胞中AFP表达量.统计学处理：用SPSS10．0统计软件包分析，采用非参MannWhitneyU两独立样本秩和检验.2结果2.1SP细胞及NonSP细胞的分选前向散射和侧向散射二维参数图证明受检细胞大小、形态、胞质均匀性一致，无PI染色细胞，无杂细胞干扰.二维散点图中Hoechstred为X轴，Hoechstblue为Y轴，在细胞集中区域(P4)左下角(P2)另