肝癌细胞系mhcc97亚群中细胞角蛋白19的表达差异

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1、肝癌细胞系MHCC97亚群中细胞角蛋白19的表达差异【关键词】肝细胞肝癌细胞角蛋白19缘群双向分化0引言原发性肝癌的发生曾归因于成熟细胞的“去分化(dedifferentiation)”,但是,近来研究认为它可能由肝干细胞(HSC)分化不全或分化异常(disdifferentiation)所致［1］.细胞角蛋白（cytokeratin,CK）的表达有组织和分化特异性.在胚胎发育过程中,胚胎肝细胞中表达CK8,CK18,CK19,随着肝脏的分化,CK19在正常肝细胞不表达,只在胆管细胞中表达［2］.当肝细胞发生癌变时,有些癌细胞又重新表达CK1

2、9,部分为分子结构不完整的CK19,且表达程度与细胞的分化程度呈负相关性［3］.近年来,利用流式细胞荧光激活分选法可以获得组织中具有原始干细胞特征的成体细胞,利用类似的方法可以将肝癌细胞分成两个不同特征的亚群［3］,因此,探讨CK19在这两个不同亚群肝癌细胞中的表达差异对阐明和验证肝癌组织中是否存在具有干细胞特征的肿瘤细胞具有重要的意义.1材料和方法1.1材料MHCC97细胞系(人高转移肝癌细胞系)购自上海复旦大学中山医院肝癌研究所.荧光染料Hoechst33342、钙离子通道拮抗剂维拉帕米、PI均购自Sigma公司；DMEM/F12培养基购

3、自Invitrogen公司、抗CK19抗体及二抗(中杉金桥)、FACSAdvantageII型六色荧光流式细胞仪(美国BD公司)、IX70Olympus激光共聚焦显微镜（日本Olympus公司).1.2方法1.2.1细胞培养复苏后的人肝癌细胞系MHCC97细胞中加入含有100mL/L胎牛血清（FCS）和加入8×104U/L青霉素、1×105U/L链霉素的DMEM，50mL/LCO2孵箱37℃孵育.1.2.2边缘群(SP)细胞及非边缘群(NonSP)细胞的检测①细胞染色:MHCC97细胞常规消化,HBSS洗涤,制备成单细胞悬液,细胞密度为1×

4、109/L.等分细胞悬液,两组均加入荧光染料Hoechst33342使终浓度为6mg/L,其中一组再加入维拉帕米,终浓度50mmol/L.37℃避光水浴90min,冰上10min终止染色,冰预冷HBSS洗涤细胞并重悬浮，再加入PI使终浓度为2mg/L.②流式细胞仪检测:355nmUV激发光源,610nm双色短通反射滤镜,450nm和675nm边缘长通滤片分别检测散射光蓝光及红光部分,线性模式采集信号.测量前向散射和侧向散射二维参数图,检测细胞均一性,以Hoechstred为X轴,Hoechstblue为Y轴作二维散点图,将低Hoechstre

5、d及低Hoechstblue且维拉帕米组缺失的区域设定为SP细胞的“门”(gate),计算百分比，分选出SP细胞及NonSP细胞.1.2.3CK19免疫细胞化学分析将两种细胞分别接种于盖玻片,培养方法同前.分别于培养4~10h，每间隔1h使用丙酮在-20℃固定细胞20min，并使用含有1mL/L吐温20的PBS液洗涤.在使用山羊正常血清封闭1h后，固定的细胞分别使用一抗鼠抗人CK19在湿盒内4℃过夜.随后使用含有1mL/L吐温20的PBS液洗涤，摇床摇洗20min.加入二抗FITC连接的山羊抗鼠IgG，37℃孵育2h.在PBS清洗后，使用3

6、00mL/L的甘油缓冲液封闭细胞爬片，IX70显微镜进行观察.CK19mAb最适工作浓度1∶100,二抗工作浓度为1∶500.统计学处理:用SPSS11.0统计软件包分析,采用配对t检验.2结果2.1SP细胞及NonSP细胞的分选前向散射和侧向散射二维参数图证明受检细胞大小、形态、胞质均匀性一致,无PI染色细胞,无杂细胞干扰.二维散点图中Hoechstred为X轴,Hoechstblue为Y轴,在细胞集中区域(P2)左下角(P1)另有小部分散点聚集(低Hoechst),而维拉帕米拮抗组无此区域,即SP细胞.占受检细胞的1.8%(图1).对P

7、1区域的SP细胞及P2区域的NonSP细胞进行分选,分别获得4×105及1×106个细胞.Hoechst（烟酸己可碱）red为X轴,Hoechstblue为Y轴(P1区为SP细胞，P2为NonSP细胞).图1流式细胞仪二维散点图2.2CK19免疫细胞化学分析SP细胞及NonSP细胞爬片4h后均贴壁,免疫细胞化学分析发现SP细胞及NonSP细胞胞质内均可见绿色荧光，其中SP细胞爬片可见许多强荧光显色.我们利用ImageProPlus5.0.2软件检测分别检测SP细胞和NonSP细胞爬片的平均积分光密度（densitymean）,结果

8、表明SP细胞及NonSP细胞中CK19的表达有统计学差异(图2,表1).表1SP细胞及NonSP细胞中CK19的表达3讨论肝细胞肝癌的发生机制是当前国内外肿瘤研