selex技术筛选弓形虫和巨细胞病毒抗体适配子及其spr传感器快速检测抗体方法学的研究

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1、第三军医大学硕士学位论文SELEX技术筛选弓形虫与巨细胞病毒抗体适配子及其SPR传感器快速检测抗体的方法学研究摘要背景：目出生缺陷给家庭、国家和社会带来极大的精神及经济负担。目前，临床对胎儿的先天性缺陷尚无有效的治疗方法。出生缺陷疾病预防的方法中，孕前期的一级预防最为有效。TORCH是一组孕期感染的病原微生物，能通过胎盘或产道引起宫内感染，导致流产、死胎或胎儿生长迟缓、先天畸形、新生儿期感染及婴、幼儿生长发育障碍。我国每年约有26，000个TORCH感染患儿出生，平均每小时就有3个，因此，TORCH筛查是孕前感染性疾病检查的重要内容。但是，据统计资料显示，我国目前诊断临

2、床普遍采用ELISA法、金标法等检测孕龄妇女血清TORCH—IgG和TORCH．IgG的水平，假阳性率较高，不能为临床提供准确的诊断依据。适配子(aptamers)是人工合成的寡核苷酸片段，近年来生物医学领域研究的热点之一。适配子能识别靶物质上的微妙结构，因此具有极高的特异性。与传统检测技术中的抗体相比，寡核苷酸适配子还具与靶分子结合力更强、稳定性好、精确性高、重复性好、可反复使用、可长期保存、可进行精确的位点修饰、筛选期更短等优势，是一种高效、快速的检测手段。同时，近年来表面等离子体共振(surfaceplasmonresonance，SPR)技术因其具有实时监测反应

3、动态过程、灵敏度较高、无需标记、无背景干扰、成本低廉等特点，被认为是生物分子检测的理想检测器件，已经成为临床实验诊断领域研究的热点。本研究拟基于课题组原有工作基础上，将适配子同靶分子结合的高特异性和SPR传感器的高灵敏性相结合，构建一种新型TORCH快速检测适配子型SPR传感器微阵列检测系统，努力为基层提供一种提供简单方便快速准确的TORCH实验室检测方法。目的：利用指数富集配体系统进化(SELEX)技术筛选能与弓形虫蛋白抗体，巨细胞病毒蛋白抗体特异结合的寡核苷酸适配子。并初步构建弓形虫与巨细胞病毒(TOX、CMV)IgG抗体的SPR传感器微阵列的快速方法检测，为实时、

4、在线监测病原菌的抗体奠定一定的技术基础。4第三军医大学硕士学位论文方法：体外合成长度为78个核苷酸的随机ssDNA文库，利用SELEX技术筛选，以弓形虫蛋白抗体，巨细胞病毒抗体为靶物质进行12轮筛选，利用生物素一亲和素显色系统检测寡核苷酸与蛋白的结合性。将筛选到的适配子库进行克隆、测序后，用DNAMAN软件对其结构进行分析，并利用捕获适配子与检测适配子组成的“三明治”夹心法对获得的适配子进行初步验证。采用SELEX技术筛选TOX—IgG与CMV-IgG的适配子，并将其整合于表面等离子共振生物传感器实时在线分析系统，我们通过在传感器表面进行固定探针分子，对溶液中的TOX—

5、IgG与CMV-IgG进行杂交检测，并进一步研究其检测方法的稳定性和线性检范围。结果：SELEX技术筛选弓形虫蛋白抗体适配子，巨细胞病毒蛋白抗体适配子的技术体系：PCR扩增的最佳退火温度为65。C；文库优化时，最佳M92+的浓度为1．5mmol／L；不对称PCR法制各ssDNA时，M92+的浓度为0．75mmol／L；以酶联板为介质筛选时，在10轮后筛选达到饱和，且随着筛选轮数的增加，PCR扩增产物的电泳条带逐渐单一、致密，亲和性检测显示第10轮获得的适配子库，弓形虫蛋白抗体比初始的文库亲和性吸光度(A)值增加了7．2倍；巨细胞病毒蛋白抗体比初始的文库亲和性吸光度(A)

6、值增加了8倍。将适配子库克隆，随机挑取7个单克隆子，利用混合夹心法检测其与弓形虫蛋白抗体，巨细胞病毒蛋白抗体的亲和性，亲和性范围分布在1．095—2．129之间(弓形虫)与1．008．2．148之间(巨细胞病毒)。二级结构分析显示，适配子与蛋白抗体亲和性的基础主要是大口袋茎环结构，口袋与环之间的茎桥含有不同数量的GC与AT碱基对；“三明治”夹心法对阴性组(非弓形虫与巨细胞病毒阳性血清)和阳性组(弓形虫抗体标准阳性血清、巨细胞病毒抗体标准阳性血清以及60例巨细胞病毒与弓形虫阳性血清标本)共75例血清样本的检测结果显示，在临界(cut-off)值为1．42时，阴性组标本的阴

7、性检出率为84．6％(弓形虫)与92．3％(巨细胞病毒)，阳性组标本的阳性检出率为87．1％(弓形虫)与90．3％(巨细胞病毒)，表现出一定的检测价值。结论：已初步筛选到与弓形虫蛋白抗体，巨细胞病毒蛋白抗体高亲和性结合的ssDNA适配子，并表现出一定的检测价值和用于临床标本检测的可能。关键词：弓形虫蛋白抗体：巨细胞病毒蛋白抗体；SELEX；DNA适配子5第三军医大学硕士学位论文MethodologyresearchofscreeningssDNAaptamersofToxoplasmaantibodyandCytomegalovirusa