双歧杆菌对轮状病毒感染肠上皮细胞il 8和tnf α分泌的影响

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1、双歧杆菌对轮状病毒感染肠上皮细胞IL8和TNFα分泌的影响【摘要】目的：探讨双歧杆菌对轮状病毒（RV）体外感染肠上皮细胞株HT29过程中IL8，TNFα分泌水平的影响.方法：按照不同的干扰措施将细胞分为正常细胞对照、RV感染、低剂量双歧杆菌干预、高剂量双歧杆菌干预4组.光镜下观察细胞病变，ELISA检测感染后6，24h细胞培养上清中IL8，TNFα的表达水平.结果：HT29细胞感染RV后6h，细胞培养上清中IL8分泌较正常细胞对照增加（P<0.01），而TNFα分泌量无显著变化（P>0.05）；感染后24h，两

2、者分泌量皆显著增高（P<0.05），细胞发生显著病变，高、低剂量双歧杆菌干预细胞均较RV感染细胞病变程度轻.干预细胞与RV感染细胞比较，6h时IL8，TNFα分泌量都未出现明显变化（P>0.05），24h时，高、低剂量干预细胞的IL8,TNFα分泌水平皆较RV感染细胞明显降低(P<0.05)，两种剂量组间无显著差别（P>0.05）.结论：RV感染诱导肠上皮细胞株HT29大量分泌致炎性细胞因子IL8,TNFα，双歧杆菌能够显著抑制该刺激分泌作用，减轻细胞病变程度，提示这种抑制作用可能参与双歧杆菌抗RV

3、感染的机制.【关键词】二裂菌属轮状病毒属肠上皮细胞白细胞介素8肿瘤坏死因子α0引言　　轮状病毒（rotavirus,RV）感染是引起儿童秋、冬季腹泻的主要病因，其高发病率、严重程度和多种并发症使其治疗受到关注.小肠成熟绒毛上皮细胞是RV感染主要侵犯的靶细胞，同时也是启动机体抗病毒应答导致临床症状的效应细胞.双歧杆菌作为肠道最重要的益生菌之一，依靠黏附于肠上皮细胞发挥其生理作用，双歧杆菌已广泛应用于临床治疗RV感染引起的腹泻，并取得较好的疗效，然而具体作用机制尚不清楚［1］.我们通过体外双歧杆菌与RV感染肠上皮细胞共培养，了解双歧杆菌对

4、RV感染肠上皮细胞IL8，TNFα分泌水平的影响.1材料和方法1.1材料两歧双歧杆菌（Bifidobacteriumbifidum）标准菌株Bif1101由重庆医科大学临床微生物学教研室提供，中国科学院微生物所鉴定.人结肠癌上皮细胞株HT29由本实验室保存；RPMI1640培养基（Gibco公司）；胎牛血清（HyClone公司）；IL8，TNFα细胞因子ELISA试剂盒（晶美生物公司）；猴轮状病毒株SA11由兰州生物制品所惠赠，在MA104细胞中增殖，收获病毒，保存于-80℃.1.2方法1.2.1双歧杆菌培养将双歧杆菌接种至B

5、L肉汤培养基，37℃厌氧培养48h，离心洗涤后置于65℃水浴，30min灭活处理，RPMI1640培养基重悬备用.1.2.2细胞培养HT29用含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养基（含1×105U/L青霉素，100mg/L链霉素，2.5g/L谷氨酰胺），37℃，50mL/LCO2常规培养.1.2.3RV感染RV在含10mg/L胰酶的无血清培养基中作用30min后，接种于长成单层的HT29细胞，吸附60min，去掉吸附液，加入含0.5mg/L胰酶的无血清RPMI1640培养基继续培养.1.2.4实验分组将细胞分为正常细胞对照、

6、RV感染、高剂量双歧杆菌干预（RV感染后立即加入终浓度为1×1012CFU/L的双歧杆菌共培养）、低剂量双歧杆菌干预（RV感染后立即加入终浓度为1×109CFU/L的双歧杆菌共培养）4部分进行.1.2.5ELISA检测IL8，TNFα表达水平分别于感染后6，24h光镜下绿光照相（LM），观察HT29细胞形态，了解细胞病变（cytopathiceffect，CPE），按病变程度分级表示，0～+：0%～25%细胞出现病变；+～：26%～50%细胞出现病变；～：51%～75%细胞出现病变；感染后6，24h收获各组细胞培养上清，离心

7、后ELISA法检测IL8，TNFα表达水平，操作严格按照试剂盒说明书进行.统计学处理：数据均以x±s表示，采用SPSS11.0软件进行统计处理，单向方差分析（oneway）,组间t检验，P<0.05认为具有统计学意义.2结果2.1形态学观察感染后6hRV感染、高剂量双歧杆菌、低剂量双歧杆菌干预细胞光镜下均未见细胞明显病变；感染后24h可见各组均出现细胞圆缩、坏死、脱落，但高、低剂量双歧杆菌干预后细胞均较RV感染细胞病变程度轻，坏死脱落细胞少（图1）.2.2双歧杆菌对RV感染HT29细胞IL8分泌的影响正常细胞对照IL8

8、水平较低，6h时RV感染后IL8分泌较正常细胞对照增加，24h增高更显著.双歧杆菌干预后与RV感染细胞比较，IL8分泌量在6h时降低不明显.高、低剂量双歧杆菌干预后24hIL8分泌量均较RV感染细胞明显降低.但两组