越桔原花青素对新生大鼠心肌成纤维细胞增殖的影响

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1、越桔原花青素对新生大鼠心肌成纤维细胞增殖的影响沈楠，王艳春，任旷，顾饶胜，范红艳【关键词】原花青素类;心肌；成纤维细胞;一氧化氮;一氧化氮合酶0引言原花青素(procyanidin，PC)是越桔重要的生物活性成分，是表儿茶素和表没食子儿茶素的低聚体或多聚体.有研究〔1-3〕发现，PC具有抗氧化、抗肿瘤、抗衰老及抗炎症等作用，但对越桔PC药理活性的相关研究还少见报道.本研究以血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导心肌成纤维细胞(CFb)增殖，观察越桔PC对CFb诱导型一氧化氮合酶一氧化氮(iN0SNO)系统的影响，以探讨PC抑制CFb增殖的初步机制.1材料和方法1.1材料TT（美国

2、Sigma公司）；IMDM，血清（GIBCO公司）；iNOS一抗（Santacruz公司）;胰蛋白酶（宝泰克生物科技公司）;羟脯氨酸试剂盒，iNOS试剂盒（南京建成生物工程公司）;TGFβ1ELISA试剂盒（晶美生物工程有限公司）；NO试剂盒（碧云天生物技术研究所）；SP试剂盒（福州迈新生物技术有限公司）；FITC羊抗兔Ig（北京中杉金桥生物技术有限公司）.1.2方法1.2.1细胞分离与培养DM培养基重悬沉淀制成细胞悬液,接种培养瓶中,置37℃，50mL/LCO2培养箱内培养.用差速贴壁法去除内皮细胞及心肌细胞.实验采用第3～5代细胞.1.2.2实验分组与处理CFb细胞分

3、为：对照组，模型组，PC药物治疗组.各组细胞无血清培育24h后，除对照组外均给予终浓度为1×10-7mol/L的AngⅡ，药物治疗组同时给予PC，终浓度分别为25，50，100mg/L，对照组给予10mL/L血清的IMDM培养基.1.2.3MTT法检测将CFb以1×108/L个细胞密度接种于96孔板,每孔200μL.分别给予不同的处理因素作用48h.每孔加入MTT溶液（5g/L）20μL，37℃继续培养4h，终止培养，每孔加入150μLDMSO，震荡10min后，酶标仪490nm波长处，测吸光度(A)值，以（各实验组A值/对照组A值）×100%表示细胞增殖率.1.2.4TG

4、Fβ1蛋白及胶原含量测定各因素处理后，分别在培养的24和48h吸取细胞上清液，按照试剂盒操作说明测定TGFβ1蛋白含量及胶原含量.1.2.5NO含量、iNOS活性测定各处理因素与CFb共孵育6h.检测细胞上清夜中NO含量及iNOS活性的变化.实验操作按NO,iNOS试剂盒说明书进行.1.2.6免疫荧光细胞化学染色将CFb加入到预先放置盖玻片的24孔板，各因素作用6h.将生长有CFb的盖玻片取出，PBS洗涤3次，40g/L多聚甲醛固定30min,山羊血清室温封闭30min；滴加一抗（兔抗大鼠,1∶50稀释）4℃过夜;PBS洗3次;再滴加FITC标记的二抗(羊抗兔),37℃

5、1h,PBS洗15min×3次;观察并拍照.用ImageProPlus图像分析软件（MediaCyberics公司）检测平均吸光度值.统计学处理：实验数据以x±s表示，组间比较采用方差分析及q检验进行.P0.05为差异具有统计学意义.2结果2.1PC对CFb增殖、胶原代谢及TGFβ1的影响与对照组相比较，AngⅡ模型组细胞增殖率、羟脯氨酸含量、TGFβ1含量均有增加（P0.01）.PC在25，50，100mg/L剂量时可抑制细胞增殖；降低羟脯氨酸及TGFβ1含量；与AngⅡ模型组相比较差异具有统计学意义（P0.05或P0.01，表1）.2.2PC对iNOS蛋白表达、

6、活性及NO含量的影响对照组CFb具有iNOS蛋白表达及活性,能够合成NO.AngⅡ模型组CFbiNOS蛋白表达减少、活性降低,NO的含量减少，与对照组比较差异具有统计学意义(P0.01).各PC药物治疗组均可增强CFb的蛋白表达及活性，提高NO含量，与AngⅡ模型组比较差异具有统计学意义（P0.05，表1）.表1原花青素对CFb增殖、胶原代谢、TGFβ1及iN0SNO系统的影响3讨论心肌纤维化是以心脏间质CFb过度增殖和胶原过度沉积为特征的心脏间质重构.研究〔2-3〕表明，AngⅡ可通过刺激CFb分泌TGFβ1而促进胶原生成.本研究以AngⅡ作用于CFb构建心肌纤维化

7、的细胞模型，实验结果显示：PC可降低AngⅡ诱导的CFbA值增高，TGFβ1增加，羟脯氨酸含量增多，表明PC可抑制心肌纤维化的发生.NO是调节心肌纤维化的重要活性物质，它的生物合成受NOS调节.体内NOS分为结构型NOS（cNOS）和诱导型NOS(iNOS).免疫组化研究〔4〕发现，成纤维细胞中只有iNOS，即CFb具有内源性iNOSNO系统.CFb合成的NO通过与铁硫基团中铁发生配位结合,抑制非血红素铁硫酶,干扰能量代谢和DNA合成；也可激活鸟苷酸环化酶从而抑制Ca2+内流,最终抑制细胞增殖和胶原合成〔5