烧伤对不同性别小鼠肝脏和脾脏铁相关蛋白的影响

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1、烧伤对不同性别小鼠肝脏和脾脏铁相关蛋白的影响：郭晓强，郭佩，张彩云，刘卫【摘要】　　目的研究不同性别小鼠肝脏和脾脏铁相关蛋白烧伤前后的变化。方法90℃水蒸气制备烧伤小鼠模型，采用比色法测定烧伤小鼠肝脏和脾脏中的铁含量，逆转录聚合酶链式反应(RTPCR)检测肝脏hepcidin和膜铁转运蛋白1(Fpn1)表达，使用ethodsTheburnmodelinmiceeasuredbycolorimetricmethod.HepatichepcidinandFpn1mRNAcontentinedinedalemice,andatthes

2、ametimetheFpn1ofliverandspleeneostasisabnormalityinfemalemiceaybeonecauseofironhomeostasisabnormality.Thedifferencesofironrelatedproteinexpressionindifferentsexafterburnssuggestthatestrogenhasapotentiallyprotectivefunction.　　KEY小鼠(清洁级)购自河北省实验动物中心，体重25～27g，雌雄各半；试剂亚铁嗪(f

3、errozine)、Trizol试剂盒、AMV逆转录酶、PCR引物、DEPC等均购自上海生工生物工程技术有限公司，小鼠Fpn1一抗为AlphaDiagnostic公司产品，TfR1一抗为invitrogen产品，actin一抗为Sigma生产，HRP标记的羊抗小鼠二抗购自北京中山金桥，发光底物为Pierce公司产品，其他试剂为国产分析纯。1.2烧伤模型小鼠的制备将12只小鼠先雌雄分开，然后1/2雌雄小鼠进行烧伤处理，另外1/2作为对照。先对所有小鼠背部使用Na2S进行脱毛处理(面积占体表总面积30%)，12h后对烧伤组小鼠裸露处用9

4、0℃水蒸气处理15s，基本达到深Ⅱ度和Ⅲ度烧伤，对照组小鼠使用室温蒸馏水处理相同时间。处理完毕后对所有小鼠禁食(减少肝糖原)，但保留水供应。12h后将所有小鼠处死，取脾脏和肝脏备用。　　1.3小鼠肝脏和脾脏铁含量的测定　　参照文献[5]并做适当修改。称取10mg干燥肝脏或脾脏组织并研碎，将其溶于100mL盐酸和300mL/L三氯醋酸混合液(1∶1)，随后使用超声处理(10s，3次)，95℃水浴30min，离心取上清。96孔板中依次加入水(空白对照)、铁标准液(84.7μmol/L)和组织上清液50μL，然后加入含10mmol/L亚铁

5、嗪和32.6mmol/L抗坏血酸TrisHCl缓冲液(浓度50mmol/L，pH4.0)50μL，37℃反应15min，用酶联免疫检测仪595nm测定各孔吸光度，将结果换算成铁浓度并计算单位克组织中肝脏和脾脏的铁含量。　　1.4肝脏hepcidin和Fpn1mRNA的RTPCR测定　　取适量小鼠肝脏组织先用Trizol试剂盒提取RNA，再通过逆转录获得cDNA，然后利用PCR扩增。Hepcidin和actin扩增20个循环(94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸1min)，Fpn1扩增29个循环(94℃变性30s，59℃

6、退火30s，72℃延伸30s)。将所得PCR产物用15g/L琼脂糖凝胶电泳分离，所得结果使用凝胶成像系统扫描并计算吸光度值。所用PCR引物为：Hepcidin：Forg组织先用蛋白裂解液1mL处理，所得溶液使用考马斯亮蓝G250测定蛋白浓度，以保证蛋白上样量为50μg。100g/L的SDSPAGE分离胶分离，300mA转膜45min，将NC膜用脱脂奶粉室温处理2.5h，一抗4℃过夜，二抗室温2h，化学发光显带，并将结果记录。　　1.6统计学处理　　小鼠肝脏和脾脏铁含量、小鼠肝脏hepcidin和Fpn1的mRNA相对含量数据采用

7、成组设计的定量资料t检验分析，结果用柱形图显示。　　RTPCR结果显示：雄性小鼠烧伤后肝脏hepcidin的mRNA相对值(以βactin为内参照)明显增加(*P<0.05)，但Fpn1没有明显变化(图2)；正常雌性小鼠hepcidin相对值低于正常雄性(*P<0.05)，烧伤后也出现显著升高(#P<0.05，图2)，但同时Fpn1表达也明显增加(#P<0.05，图2)(注：*表示与正常雄性小鼠比较，而#表示与正常雌性小鼠比较)。　　2.3烧伤对小鼠肝脏和脾脏Fpn1及肝脏TfR1蛋白含量的影响　　AKH

8、H,ARPANI,etal.Hepcidinantimicrobialpeptidetransgenicmiceexhibitfeaturesoftheanemiaofinflammation[J].Blood,2007,109(9)