诱骗寡核苷酸下调mkn45细胞op18 基因表

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1、诱骗寡核苷酸下调MKN45细胞OP18基因表【摘要】目的：探讨转录因子E2F哑铃形诱骗寡核苷酸（DecoyODNs）对MKN45细胞中op18基因转录调控的影响及对细胞增殖的抑制作用．方法：设计合成针对op18启动子上E2F的结合位点序列的哑铃形DecoyODNs，然后将合成的序列进行退火、连接，使其形成哑铃形的结构，再应用阳离子脂质体LipofectamineTM2000将哑铃形DecoyODNs转染MKN45细胞中．TRIzol法提取细胞总RNA，用RTPCR方法检测细胞中op18mRNA表达水平的变化．通

2、过MTT实验监测细胞的生长增殖状况并绘制生长曲线，最后用TUNEL法观察细胞的凋亡的情况．结果：哑铃形DecoyODNs被成功转染MKN45细胞，并成功提取了细胞总RNA.RTPCR检测发现哑铃形DecoyODNs转染后的MKN45细胞中op18mRNA表达水平明显低于空白对照组，MTT实验所作的生长曲线显示转染细胞增殖速度与空白对照组相比较明显减慢，TUNEL凋亡染色可见凋亡细胞．结论：哑铃形DecoyODNs能特异性抑制E2F转录因子对op18基因的转录调控，进而抑制op18基因表达及MKN45细胞增殖．【

3、关键词】圈套寡核苷酸；转录因子；细胞增殖；基因疗法　　E2F最初作为腺病毒（adenovirus,Ad）E2启动子的活化因子被发现［1］，它是细胞周期调控过程中起重要作用的转录因子，E2F调控异常存在于多种肿瘤细胞中［2］．靶向E2F转录因子是肿瘤基因治疗的策略之一．目前在治疗多种肿瘤的体内外动物实验中均取得了良好效果，包括非小细胞肺癌、胃癌及乳腺癌等［3-4］.op18（又称oncoprotein18,stathmin）是一种高度保守的细胞内蛋白，该蛋白在恶性肿瘤发生、发展及决定表型上具有重要作用及意义［5］．Pol

4、zin等［6］发现op18基因启动子上有E2F的结合位点，说明op18基因是转录因子E2F调控的靶基因，但截至目前E2F对op18基因的具体调控机制仍未阐明.本实验应用诱骗寡核苷酸（decoyoligodeoxynucleotides,DecoyODNs）策略来研究转录因子E2F对op18基因表达及肿瘤细胞的生物学行为影响，初步探讨E2F对op18基因的调控，旨在为肿瘤的生物治疗寻找新的技术方法．　　1材料和方法　　1.1材料　　MKN45细胞（人低分化胃癌细胞株）唐都医院中心实验室保存；TRIzol，Lipofec

5、tamineTM2000(Invitrogen公司）；TaqDNA聚合酶，DGL2000DNAMarker(北京鼎国生物技术有限公司)；DMEM培养液，1640培养液(GIBCO公司)；T4DNA连接酶(Promega公司)；所有PCR扩增引物及E2FDecoy序列均由上海英骏生物工程公司合成；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)．　　1.2方法　　1.2.1E2F基因Decoy寡核苷酸设计合成及实验分组　　根据Polzin等［6］提供的op18基因启动子上E2F的结合位点序列，00μLStre

6、ptavidingHRP溶液5min，加100μLDAB工作液显色并封片．空白对照不加TdT酶，其余步骤同前．　　2结果　　2.1DecoyODNs对细胞中op18基因的表达的影响　　RTPCR扩增产物电泳结果显示，op18基因的mRNA表达水平在EOP1组降低最显著，EOP1和EOP2共转染组次之，其次是EOP2组，EOPm组与未转染的MKN45细胞中op18基因的mRNA表达水平未见下调（图2）．　　2.2细胞增殖的变化　　E2FDecoyODNs处理的MKN45细胞与空白对照组比较可见生长受到明显抑制．EO

7、P1组在第7d抑制作用最显著，细胞相对抑制率为65.7%；EOP1+EOP2组次之，细胞相对抑制率为47.9%；其次是EOP2组，细胞相对抑制率为32.3%；EOPm组与空白对照组结果一致（图3）．　　2.3肿瘤细胞凋亡检测结果　　于转染后1，3，5，7及9d分别收集细胞爬片，TUNEL法染色结果显示：于转染后3dE2F圈套寡核苷酸处理MKN45细胞开始出现凋亡，至7d凋亡达到高峰．各实验组中，EOP1组凋亡最显著，EOP1+EOP2组次之，其次是EOP2组，EOPm组与空白对照组未见明显阳性凋亡细胞（图4）．　　3

8、讨论　　op18基因是从淋巴瘤中筛选出的特征性的表达基因，其编码的蛋白为一种高度保守的细胞内蛋白，在细胞周期中可被蛋白激酶磷酸化，阻断op18磷酸化将使细胞分裂停止于G2/M期．细胞内微管相关蛋白磷酸化过程中op18是重要调节因子，直接影响细胞分裂与增殖［5］．DecoyODNs可以使转录因子的转录活性降低，使其丧失与内源基因作用