诱骗寡核苷酸下调mkn45细胞op18基因表达及对细胞增殖的影响

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1、诱骗寡核苷酸下调MKN45细胞OP18基因表达及对细胞增殖的影响【摘要】目的：探讨转录因子E2F哑铃形诱骗寡核苷酸（DecoyODNs）对MKN45细胞中op18基因转录调控的影响及对细胞增殖的抑制作用．方法：设计合成针对op18启动子上E2F的结合位点序列的哑铃形DecoyODNs，然后将合成的序列进行退火、连接，使其形成哑铃形的结构，再应用阳离子脂质体LipofectamineTM2000将哑铃形DecoyODNs转染MKN45细胞中．TRIzol法提取细胞总RNA，用RTPCR方法检测细胞中op18mRNA表达水平的变化．通过MTT实验监测细胞的生长增殖状况并绘制

2、生长曲线，最后用TUNEL法观察细胞的凋亡的情况．结果：哑铃形DecoyODNs被成功转染MKN45细胞，并成功提取了细胞总RNA.RTPCR检测发现哑铃形DecoyODNs转染后的MKN45细胞中op18mRNA表达水平明显低于空白对照组，MTT实验所作的生长曲线显示转染细胞增殖速度与空白对照组相比较明显减慢，TUNEL凋亡染色可见凋亡细胞．结论：哑铃形DecoyODNs能特异性抑制E2F转录因子对op18基因的转录调控，进而抑制op18基因表达及MKN45细胞增殖．【关键词】圈套寡核苷酸；转录因子；细胞增殖；基因疗法　　E2F最初作为腺病毒（adenovirus,A

3、d）E2启动子的活化因子被发现［1］，它是细胞周期调控过程中起重要作用的转录因子，E2F调控异常存在于多种肿瘤细胞中［2］．靶向E2F转录因子是肿瘤基因治疗的策略之一．目前在治疗多种肿瘤的体内外动物实验中均取得了良好效果，包括非小细胞肺癌、胃癌及乳腺癌等［3-4］.op18（又称oncoprotein18,stathmin）是一种高度保守的细胞内蛋白，该蛋白在恶性肿瘤发生、发展及决定表型上具有重要作用及意义［5］．Polzin等［6］发现op18基因启动子上有E2F的结合位点，说明op18基因是转录因子E2F调控的靶基因，但截至目前E2F对op18基因的具体调控机制仍未阐明.本

4、实验应用诱骗寡核苷酸（decoyoligodeoxynucleotides,DecoyODNs）策略来研究转录因子E2F对op18基因表达及肿瘤细胞的生物学行为影响，初步探讨E2F对op18基因的调控，旨在为肿瘤的生物治疗寻找新的技术方法．　　1材料和方法　　1.1材料　　MKN45细胞（人低分化胃癌细胞株）唐都医院中心实验室保存；TRIzol，LipofectamineTM2000(Invitrogen公司）；TaqDNA聚合酶，DGL2000DNAMarker(北京鼎国生物技术有限公司)；DMEM培养液，1640培养液(GIBCO公司)；T4DNA连接酶(Promega公

5、司)；所有PCR扩增引物及E2FDecoy序列均由上海英骏生物工程公司合成；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)．　　1.2方法　　1.2.1E2F基因Decoy寡核苷酸设计合成及实验分组　　根据Polzin等［6］提供的op18基因启动子上E2F的结合位点序列，参考文献［7］的方法，合成哑铃形DecoyODNs，序列如下：EOP1：5′GGATCCCTTTCCCGCACAGGAAAACCTGTGCGGGAAAG3′，EOP2：5′GGATCCTTTGGCGGGAGTTAAAAAACTCCCGCCAAA3′，EOPm(突变对照）：5′GGATC

6、CTTTGGCGAACGTTAAAAAACGTTCGCCAAA3′.斜体部分为op18基因启动子上E2F的结合位点，框内部分为loop，下划线部分为BamHI酶切位点.EOPm的序列是将E2F的结合位点序列进行了突变，作为突变对照．应用梯度退火的方法使合成的序列形成哑铃形的结构．取退火产物4μL，用T4DNA连接酶做连接，体系条件按该酶说明书（图1）．根据实验要求分为五组：EOP1组：转染EOP1DecoyODNs的MKN45细胞；EOP2组：转染EOP2DecoyODNs的MKN45细胞；EOP1+EOP2组：转染EOP1和EOP2DecoyODNs的MKN45细胞

7、；EOPm组(突变对照）：转染EOPmDecoyODNs的MKN45细胞；　　1.2.2脂质体介导E2F基因DecoyODNs的细胞转染　　转染前1d，在100mm平皿中按0.6×105细胞/皿接种MKN45细胞．脂质体转染操作步骤按LipofectamineTM2000说明书进行．于转染后8h换为完全DMEM培养液继续培养72h，分别收集各组的MKN45细胞进行功能研究．　　1.2.3RTPCR检测　　转染细胞op18基因的表达收集不同组的MKN45细胞，分别用TRIzol法提取