《苏州地区5岁以下儿童轮状病毒性腹泻的分子流行病学研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
：１０３１２分类号：Ｒ６单位代码：２０１５１６４４密级：学号硕士学位论文苏州地区５岁以下儿童轮状病毒性腹泻的题目：分子流行病学研究研究生：徐承指导教师：学科专业：临床检验诊断学二学院名称：南京医科大学第临床医学院二一八年五月完成时间：〇 分类号：R6单位代码：10312密级：学号：20151644硕士学位论文苏州地区５岁以下儿童轮状病毒性腹泻的题目：分子流行病学研究研究生：徐承指导教师：朱叶飞学科专业：临床检验诊断学学院名称：南京医科大学第二临床医学院完成时间：二〇一八年五月 南京医科大学硕士学位论文缩略词表英文缩写英文全称中文全称RVRotavirus轮状病毒ReversetranscriptionpolymeraseRT-PCR反转录聚合酶链式反应chainreactionASantigenicsite抗原位点dsRNADouble-strandedribonucleicacid双链核糖核酸VPViralprotein结构蛋白NSPNonstructuralprotein非结构蛋白TBETrisboricacidEDTATris-硼酸电泳缓冲液DEPCDiethylpyrocarbonate焦碳酸二乙酯DNADeoxynucleicacid脱氧核糖核酸VRVariableregion可变区GMMonosialotetrahexosylganglioside神经节苷脂HBGAHisto-bloodgroupantigen血型组织抗原HSP-70Heatshockproteins70热休克蛋白70DLPDoublelayeredparticle双层蛋白颗粒ECEnterochromaffincell肠嗜铬细胞5-HT5-hydroxytryptamine5-羟色胺 南京医科大学硕士学位论文目录中文摘要························································································1Abstract··························································································4前言······························································································8第一部分苏州地区5岁以下儿童轮状病毒腹泻的流行病学特征·················11材料与方法···············································································11结果························································································18讨论························································································23小结························································································26第二部分2010~2016年流行株G9P[8]的全基因组测序分析·······················27材料与方法···············································································27结果························································································33讨论························································································49小结························································································53参考文献························································································54文献综述························································································60攻读学位期间发表论文·····································································71致谢······························································································72 南京医科大学硕士学位论文苏州地区５岁以下儿童轮状病毒性腹泻的分子流行病学研究中文摘要目的研究2010~2016年苏州地区5岁以下儿童轮状病毒（Rotavirus,RV）性腹泻的流行病学概况及分子流行特征，探讨流行毒株的分子演化机制，为预防和治疗RV感染提供科学依据。方法1.按照纳入标准和排除标准收集2010.01~2016.12期间在苏州儿童医院因腹泻住院的5岁以下患儿的粪便标本，并采集病例信息（包括年龄、性别、发病时间等）。将收集的腹泻标本提取核酸，通过实时荧光定量PCR（Real-timeRT-PCR）来鉴定RV。结合病例信息，利用SPSS17.0软件统计分析相关指标。所有Real-timeRT-PCR检测阳性的标本进行巢式RT-PCR，分别扩增病毒的VP7和VP4片段，以判断RV的G/P分型，并分析其分子流行病学特征。2.对2010~2016年期间的流行毒株G9P[8]进行全基因组扩增测序（每年选取1株，共7株，分别命名为JS2010~JS2016）。利用RotaC2.0（http://rotac.regatools.be/）对RV的11个基因片段进行分型，用MEGA5.0软件绘制系统进化树，以确定其基因变化情况及演化趋势。结果1.苏州地区RV流行概况1.1苏州地区5岁以下儿童RV腹泻的流行病学特征2010~2016年研究期间，共收集腹泻标本2658例，其中男性患儿1566例，女性患儿1092例。诊断为RV感染腹泻的为914例，所占比例为34.39%（914/2658)，其中男性患儿RV腹泻的病例数为567例，构成比为62.04%（567/914），阳性率1 南京医科大学硕士学位论文为36.21%（567/1566），女性患儿RV腹泻的病例数为347例，构成比为37.96%（347/914），阳性率为31.78%（347/1092），男女患儿间RV的阳性率无显著性差异（χ2=5.597，P=0.18）。病例主要集中在35月龄以下儿童（95.62%，874/914），其中12~17月龄所占比例最高（39.17%，358/914），其次是6~8月龄（15.54%，142/914）和9~11月龄（14.99%，137/914）。各年龄组RV的阳性率分别为0~2月龄19.25%（41/213）、3~5月龄24.48%（83/339）、6~8月龄29.16%（142/487）、9~11月龄39.14%（137/350）、12~17月龄49.04%（358/730）、18~23月龄32.24%（49/152）、24~35月龄29.63%（64/211）、36~47月龄26.60%（25/87）、48~59月龄15.15%（15/89），不同年龄段患儿RV的阳性率有显著性差异（χ2=130.467，P=0.0001）。RV腹泻呈明显的季节性分布，其中2016年1~12月份的RV阳性率依次为：1月70.45%（31/44）、2月64.71%（11/17）、3月42.11%（8/19）、4月15.00%（3/20）、5月11.54%（3/26）、6月10.00%（2/20）、7月0.00%（0/28）、8月2.50%（1/40）、9月8.00%（2/25）、10月10.00%（3/30）、11月53.13%（17/32）、12月58.14%（25/43），感染的高峰期是11月至次年2月，其中1月份RV阳性率最高。不同月份RV的阳性率有显著性差异（χ2=181.426，P=0.0001）。1.2RV的G/P分型分布G基因型分型结果显示：G9从2012年开始成为最主要的流行基因型，占61.16%（559/914）；其次是G1型（15.10%，138/914），G3型（10.39%，95/914），G2型（7.44%，68/914）；另检出4例G4型和混合感染14例（主要以G3+9和G1+9的形式存在）；36例（3.94%，36/914）未能分型。P基因型分型结果显示：以P[8]为主，占87.09%（796/914）；其次为P[4]，占7.88%（72/914）；另检出混合感染P[4+8]16例；30例（3.28%，30/914）未能分型。G/P组合基因型特征：G9P[8]型从2012年起成为苏州地区RV腹泻的主要流行基因型组合，占58.42%（534/914），其次是G1P[8]型（13.46%，123/914）和G3P[8]型（10.61%，97/914）；另检出G2P[4]型38例，G2P[8]型29例，G9P[4]2 南京医科大学硕士学位论文型15例，G1P[4]型11例和G3P[4]型5例；G和（或）P混合感染22例；40例（4.38%，40/914）未能分型。2.G9P[8]全基因组分析全基因组分析结果显示，7株G9P[8]毒株基因分型特征均表现为G9-P[8]-I1-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E1-H1，属于Wa-like基因组。VP7基因片段分属于2个分支（G9-III和G9-VI），毒株间核苷酸同源性为90.75%~99.90%；VP4基因片段也属于2个分支（P[8]-3和P[8]-4），毒株间核苷酸同源性为84.93%~99.60%。与相应的原始毒株相比，在VP7和VP4基因片段的抗原决定区中均出现了较多的氨基酸突变。此外在NSP4的抗原位点（antigenicsites,AS）I和II中也发现了氨基酸变异。结论本研究表明RV仍是苏州地区5岁以下儿童病毒性腹泻的主要病原体。RV感染具有明显的季节性，发病高峰期集中在每年的秋冬季。RV毒株随着时间不断发生演变。当前苏州地区主要流行株为G9P[8]，并一直处于缓慢变化中。因此，需持续监测该地区RV腹泻流行情况，加强对毒株流行特点和基因型别变化的研究，为预防和控制RV感染提供科学依据。关键词：轮状病毒，基因分型，全基因组测序3 南京医科大学硕士学位论文Molecularepidemiologicalanalysisofrotavirusprevalentinchildrenlessthan5yearsoldinSuzhouAbstractObjectionTostudytheinfectioussituationandmolecularepidemiologicalcharacteristicsofrotavirus(RV)amongchildrenlessthan5yearsoldinSuzhouduringtheyearsfrom2010to2016,toexplorethemolecularevolutioncharacteristicsofstrains,toprovidescientificbasisforbetterpreventionandtreatmentofRVinfection.Methods1.Fecalsampleswerecollectedfromchildrenlessthan5yearsoldwithdiarrheaatSuzhouChildren’sHospitalduringtheperiodfromJan,2010toDec,2016.ViralRNAofallthesampleswasextractedandthentestedforRVbyreal-timeRT-PCR.Thepatientdataincludingage,sex,anddatesofdiseaseonsetwerealsocollected.SPSS17.0wasusedtoanalysistherelevantparameters.NestedRT-PCRwasusedtoamplifytheVP7andVP4genesofthestrainswhichwerepositiveforRVforfurtherG/Pgenotyping,toanalysisthemolecularepidemiologicalcharacteristics.2.Individualgenefragmentsof7G9P[8]strainswereamplifiedandthePCRproductsweresequenced.Allthe11genefragmentsgenotypesweredeterminedbyuseofRotaC2.0(http://rotac.regatools.be/)andthephylogeneticrelationshipswereinferredbyuseofMEGA5.0,toexplorethegeneticchangesandevolutionarytrend.Results1.TheinfectioussituationofRVinSuzhou1.1EpidemiologicalcharacterisisticsofRVamongchildrenlessthan5yearsoldinSuzhou4 南京医科大学硕士学位论文Atotalof2658sampleswerecollectedduringtheperiodfrom2010to2016,including1566frommaleand1092fromfemale.914outof2658(34.39%)werepositiveforRV,amongwhich567cases(62.04%,567/914)weremaleand347cases(37.96%,347/914)werefemale.RVpositiveratesofmaleandfemalewere36.21%(567/1566)and31.78%(347/1092),respectively.Therewasnosignificantdifferenceingender（χ2=5.597,P=0.18).Outofthe914RVpositivecases,mostcases(95.62%,874/914)wereinchildren<35monthsgroup,amongwhich358cases(39.17%,358/914)in12~17monthsgroup,followedbycasesin6~8months(15.54%,142/914)andthosein9~11months(14.99%,137/914).RVpositiveratesofdifferentagegroupswere19.25%(41/213)for0~2months,24.48%(83/339)for3~5months,29.16%(142/487)for6~8months,39.14%(137/350)for9~11months,49.04%(358/730)for12~17months,32.24%(49/152)for18~23months,29.63%(64/211)for24~35months,26.60%(25/87)for36~47monthsand15.15%(15/89)for48~59months,therewassignificantdifferenceinage(χ2=130.467,P=0.0001).RVinfectionswerefoundwholetheyear,butshowedadistinctseasonalpatterninSuzhou.RVpositiveratesofdifferentmonthsintheyear2016were70.45%(31/44)forJanuary,64.71%(11/17)forFebruary,42.11%(8/19)forMarch,15.00%(3/20)forApril,11.54%(3/26)forMay,10.00%(2/20)forJune,0.00%(0/28)forJuly,2.50%(1/40)forAugust,8.00%(2/25)forSeptember,10.00%(3/30)forOctober,53.13%(17/32)forNovemberand58.14%(25/43)forDecember，withepidemicpeaksoccurringpredominantlyinmonthsfromNovembertoFebruarynextyear.ThepositiveratewashighestinJanuary(70.45%,31/44).Therewassignificantdifferenceinmonth(χ2=181.426,P=0.0001).1.2G/PgenotypedistributionofRVGgenotype:G9hasbecomethepredominateG-type(61.16%,559/914)since2012,followedbyG1(15.10%,138/914),G3(10.39%,95/914),G2(7.44%,68/914),5 南京医科大学硕士学位论文G4(0.4%,4/914).Co-infections(G3+9andG1+9)weredetectedin14samples.3.94%(36/914)ofpositivesampleswasfailedtodetermineitsGgenotype.Pgenotype:P[8]wasthemostcommonP-type(87.09%,796/914),followedbyP[4](7.88%,72/914).Co-infections(P[4+8])weredetectedin16samples.3.28%(30/914)ofpositivesampleswasunclassifiedPgenotype.G/Pgenotype:G9P[8]hasbecomethemostcommonstrain(58.4%,534/914)prevalentinSuzhousince2012,followedbyG1P[8](13.46%,123/914),G3P[8](10.61%,97/914),G2P[4](4.16%,38/914),G2P[8](3.17%,29/914),G9P[4](1.64%,15/914),G1P[4](1.20%,11/914)andG3P[4](0.55%,5/914).Co-infectionsofG/Pwere22casesandun-typed40cases.2.Whole-genomeanalysisofG9P[8]Allthe7studyG9P[8]strainsshowedtheWa-likeconstellation,withthemolecularcharacteristicsG9-P[8]-I1-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E1-H1.TheVP7genesclusteredintolineageG9-IIIandG9-VI,withnucleotideidentitiesrangedfrom90.75%~99.90%.MostoftheVP4sequencesbelongedtotheP[8]-3lineageandoneinP[8]-4lineage.Nucleotideidentitiesof84.93%~99.60%werenotedforVP4genes.AminoacidchangeswerepresentintheantigenicregionsoftheVP7andVP4geneswhencomparedtotherelatedprototypestrains.TherewerealsomultiplemutationsinantigenicsitesIandIIofthenonstructuralproteins4(NSP4)genes.ConclusionsThisstudyindicatesthatRVistheleadingcauseofacuteviralgastroenteritisamongchildrenlessthan5yearsofageinSuzhou.RVinfectionsdisplayadistinctseasonalpattern,withepidemicpeaksoccurringpredominantlyintheautumnandwintermonths.RVvariesacrossregionsandtime.G9P[8]isthemostcommongenotypeandhasbeenpersistentlyprevalentinSuzhouwithslowmutationrate.Hence,continuedsurveillanceisnecessarytoexploretheepidemiologyand6 南京医科大学硕士学位论文molecularevolutionarycharacteristicsofRV.Keywords:rotavirus,genotype,whole-genomeanalysis7 南京医科大学硕士学位论文前言轮状病毒（Rotavirus,RV）属于呼肠病毒科，轮状病毒属，完整的病毒颗粒呈球形，直径70nm左右，无包膜，具有多层衣壳蛋白，电镜下观察呈车轮状。其基因组由11个不连续的双链RNA（double-strandedRNA,dsRNA）组成，依次命名为基因1至基因11，编码6个结构蛋白（VP1~4,VP6,VP7）和6个非结构蛋白（nonstructuralprotein,NSP1~5/6），除第11个片段含有两个开放阅读框并编码NSP5和NSP6外，其它每一个基因片段分别编码一种蛋白[1]。6个非结构蛋白NSP1~5/6在病毒复制、翻译及出芽过程中发挥重要作用；6个结构蛋白则参与构架病毒颗粒，其中，VP1~3是病毒的核心结构蛋白，VP4、VP6和VP7则是形成病毒衣壳的主要结构蛋白。VP6具有群特异性，根据其抗原特性可将RV分为A~H八个组。A~C及H均可以感染人类，A组RV感染最为常见。VP7和VP4具有型特异性；根据VP7的抗原特异性可对RV进行G（glycoprotein）分型，根据VP4可进行P（protease-sensitive）分型[2]。Matthijnssens等在2008年提出了根据RV的11个基因片段的（VP7-VP4-VP6-VP1-VP2-VP3-NSP1-NSP2-NSP3-NSP4-NSP5/NSP6）核苷酸序列同源性将毒株命名为Gx-Px-Ix-Rx-Cx-Mx-Ax-Nx-Tx-Ex-Hx的分类方法[3]，该方法能更好地定义毒株间的同源关系。据此，人类RV主要分为三大基因组：Wa-like基因组(Gx-P[8]-I1-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E1-H1)、DS-1-like基因组(Gx-P[4]-I2-R2-C2-M2-A2-N2-T2-E2-H2)和AU-1-like基因组(Gx-P[9]-I3-R3-C3-M3-A3-N3-T3-E3-H3)[4,5]。常见的G1、G3、G4、G9、G12和P[8]型都属于Wa-like基因组，G2和P[4]型别的毒株则属于DS-1-like基因组，AU-1-like基因组在人类感染中很少被检测到。RV是引起世界范围内5岁以下儿童病毒性腹泻的主要病原体，有报道称5岁以下儿童都至少感染过一次RV。无论在发达国家和发展中国家，RV感染都很普遍，且公共卫生条件的改善和食品安全性的提高对RV发病率影响较小。全世界每年约有1.11亿的婴幼儿因RV感染而发生严重的腹泻，超过45万名5岁以下儿童死于RV感染，大多数死亡病例出现在发展中国家，其中41%的病例发8 南京医科大学硕士学位论文生在亚洲[6,7]。在美国，每年死于RV感染的病例数达20~40例。我国，5岁以下儿童每年病毒性腹泻门诊约2500万例，其中47.8%是RV引起的腹泻，累计医疗花费近8亿元[8]。RV具有多样性、分布广的特点。全球范围内引起儿童RV腹泻的主要G基因型包括G1、G2、G3、G4、G9和G12[9,10]。我国RV流行的G基因型与世界流行的型别大致相似，但在不同地区流行毒株存在差异，例如我国在1998~2000年间的主要流行G基因型为G1[11]，但河北1998年RV腹泻流行毒株以G3型为主[12]，重庆地区1998~1999年流行株由G1转变为G3型[13]，兰州地区2000年流行的主要基因型为G3[14]。在1998~2000年期间苏州地区的流行毒株主要为G3型。即使在同一地区，不同时间段的流行毒株也不一定相同。2001~2006年兰州地区RV监测结果显示，在2001~2004年，流行毒株以G3型为主，2004~2005年流行型别则由G3向G1型过渡，2005~2006年G1型占据优势地位[15]。P基因型的多样性较G基因型来说相对较少，全球范围内流行的P基因型主要表现为P[4]、P[6]和P[8][16]，我国以P[8]型最为常见，其次是P[4]和P[6]。RV基因组具有节段性的特点，因此不同型别的RV毒株在同一宿主体内共感染时，可能会造成11个基因片段转换而发生重配，导致新的变异株的产生[17]。而且RV属于RNA病毒，RNA聚合酶在复制过程中缺乏校对功能，RV极易发生点突变，随着点突变的积累会导致抗原漂移也会增加其多样性。若VP7和VP4重要抗原区的点突变不断累积，则会产生新的变异株。目前，尚未研制出用于治疗RV感染的特效药物。口服疫苗是主要的预防措施。变异株的产生也会使疫苗的保护效果下降，甚至会对疫苗产生抗性。因此，需持续监测RV以了解其感染流行状况及流行毒株的演化趋势。上世纪70年代末，研究者们便开始致力RV疫苗的研究。1998年，第一种RV疫苗（RotaShieldTM）上市，但由于诱发肠套叠的风险较高，1999年底，美国即停止了该疫苗的使用。目前，全世界应用较多的疫苗主要有比利时的单价疫苗（Rotarix）和美国的五价疫苗（RotaTeq）。Rotarix和RotaTeq已被多个国9 南京医科大学硕士学位论文家纳入儿童免疫计划。据报道，这两种疫苗对RV均有一定的保护作用，但保护效果与地区经济发展水平有关，经济收入较高的地区RV疫苗的保护效果明显好于经济收入较低的地区[18-20]，但由于Rotarix和RotaTeq两种疫苗价格较高，尚未在许多发展中国家普遍应用。LLR是由我国兰州生物制品研究所研发的单价G10P[15]口服活疫苗，现仅限在国内使用。疫苗接种后，RV感染的发生率有所降低。但RV毒株型别多样易变，因此需持续监测RV流行情况，对研发高效而经济的RV疫苗是非常必要的。前期已完成2010~2015年苏州地区5岁以下儿童病毒性腹泻标本的收集，本课题组继续收集了2016年腹泻标本。分析苏州地区2010~2016年RV腹泻流行情况及基因型分布，探究该地区RV腹泻的流行病学规律。并选取2010~2016年间流行毒株G9P[8]进行全基因组测序，研究其基因变异和进化趋势，为预防和控制RV感染提供参考依据。10 南京医科大学硕士学位论文第一部分苏州地区5岁以下儿童轮状病毒性腹泻的流行病学特征材料与方法1.研究对象1.1纳入标准和排除标准纳入标准：（1）5岁以下儿童；（2）大便次数增加（≥3次/天）；（3）大便性状发生改变（可为糊状、蛋花样、水样）；（4）家长同意留取标本并提供基本信息。排除标准：（1）年龄>5岁；（2）粘液脓血便，粪便常规镜检有真菌或巨噬细胞，白细胞及红细胞数明显增多；（3）家长拒绝留取患儿大便标本或基本信息。1.2标本采集收集2010.01~2016.12期间在苏州市儿童医院住院的5岁以下腹泻患儿的粪便标本（其中2010.01~2015.12为前期收集并保存的标本），其中符合纳入标准的标本共2658份。2.实验材料2.1主要试剂试剂名称来源氯化钠注射液安徽双鹤5×MagMAXTM-96ViralIsolationKit试剂盒美国ABIQIAGENProbeRT-PCRKit试剂盒德国QIAGENQIAGENOneStepRT-PCRKit试剂盒德国QIAGENRegularAGAROSEG-10琼脂糖上海玉博GoldViewNucleicAcidStain北京Solarbio11 南京医科大学硕士学位论文5×TBEbuffer上海生工6×LoadingBuffer日本TaKaRaDL1500DNAMarker日本TaKaRaDEPC水上海生工2.2主要仪器设备设备名称来源ABI核酸自动提取仪美国ABI7500荧光PCR仪美国ABI梯度PCR仪Veriti美国ABI金属浴美国Eppendorf制冰机意大利Scotsman电泳仪美国BIA-RAD紫外灯箱上海鄂禾凝胶成像仪美国BIA-RAD微量加样器美国Eppendorf-20℃冰箱海尔-80℃深低温冰箱美国BIO-RAD高速离心机美国Eppendorf电子天平BS300S-WE1德国Sartorius微波炉美的生物安全柜美国Baker3.实验方法3.1标本的预处理用吸管从粪便采集管中吸取0.5g粪便标本，分装到1.5ml消毒灭菌的EP管中，加入0.9%氯化钠注射液，配成10%粪便悬浮液，置于漩涡振荡器中振荡2min混匀。将便悬液置于高速离心机中，以8000rpm离心1min，吸取上清分装到1.5ml12 南京医科大学硕士学位论文的无菌EP管中，-80℃保存备用。3.2核酸提取（1）待5×MagMAXTM-96ViralIsolationKit试剂盒平衡至室温后，在第一个96孔加样板上依据样本顺序编号；（2）预设阴性对照和空白对照2孔；（3）在第1个96孔加样板中每孔加入磁珠及增强液各10μl。依据样本编号在每孔加入上述便悬液50μl，阴性对照孔加入试剂和50μl的生理盐水，空白对照孔仅加试剂；（4）再向第1个加样板中每孔加入裂解结合液130μl；（5）取第2、3个加样板，依据第1板的加样位置每孔加入洗液1为150μl；（6）取第4、5个加样板，依据第1板的加样位置每孔加入洗液2为150μl；（7）取第6个加样板，依据第1板加样位置每孔加入核酸洗脱液50μl；（8）取第7个加样板，放置磁搅拌棒；（9）将1~7个加样板按序放入ABI核酸自动提取仪，选择AM1836-V2程序，启动提取核酸；（10）程序运行结束后，收取第6个加样板，其为病毒核酸，-20℃保存，用于后续试验。3.3Real-timeRT-PCR定性检测RV3.3.1引物及探针参照GenBank中人RV非结构蛋白NSP3相对保守的核苷酸序列和文献[21]，设计适合本研究中RV的引物及探针序列见表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。表1.RVTaqManRT-PCR引物和探针引物/探针序列（5’→3’）NSP3-FACCATCTWCACRTRACCCTCNSP3-RGGTCACATAACGCCCCNSP3-R1GGTCACATAACGCCCCTATANSP3-ProbeATGAGCACAATAGTTAAAAGCTAACACTGTCAA注：F表示上游引物，R表示下游引物13 南京医科大学硕士学位论文3.3.2反应体系Real-timeRT-PCR反应体系的配置，共12.5μl，在冰盒上进行，见表2。表2.RVReal-timeRT-PCR反应体系试剂体积（μl）DEPCH2O2.625NSP3-F0.25NSP3-R0.25NSP3-R10.25NSP3-Probe0.25RT-PCRMasterMix6.25QuantiTect®RT-MIX0.125RNA模板2.53.3.3反应程序50℃30min→95℃15min→(95℃15sec→60℃1min)×45。3.3.4结果判读反应完成后，读取各标本对应的Ct值来判断是否为RV感染。（1）Ct值无数值的标本为阴性标本；（2）Ct值<35.0的标本为阳性标本；（3）Ct值≥35.0的标本建议重做。重做结果无数值者为阴性，否则为阳性标本；（4）阴性对照和空白对照应均无Ct值；否则实验失败，重做实验。3.4RV的G/P分型检测3.4.1分型引物参照GenBank中RV毒株序列和文献[22,23]设计适合本研究中RV的G/P多重分型引物，见表3。14 南京医科大学硕士学位论文表3.RV的G/P分型引物引物序列（5’→3’）VP4FTATGCTCCAGTNAATTGGPVP4RATTGCATTTCTTTCCATAATG分P4CTATTGTTAGAGGTTAGAGTC型P6TGTTGATTAGTTGGATTCAA引P8TCTACTGGRTTRACNTGC物P9TGAGACATGCAATTGGACP10ATCATAGTTAGTAGTCGGP11GTAAACATCCAGAATGTGVP7FATGTATGGTATTGAATATACCACGVP7RAACTTGCCACCATTTTTTCC分G1CAAGTACTCAAATCAATGATGG型G2CAATGATATTAACACATTTTCTGTG引G3ACGAACTCAACACGAGAGG物G4CGTTTCTGGTGAGGAGTTGG8GTCACACCATTTGTAAATTCGG9CTTGATGTGACTAYAAATAC注：F表示上游引物，R表示下游引物3.4.2反应体系及反应条件（1）引物配置：将G(P)各型特异性引物按照1:1:1:1:1:1比例配置成G(P)分型混合下游引物。（2）变性：反应体系的配置，共10μl体系，在冰盒上进行，见表4。表4.核酸变性反应体系试剂体积（μl）H2O320µMVP7F(VP4)120µMVP7R(VP4)1RNA模板5上述反应体系配置完成后，置于金属浴中98℃变性5min，冰内冷却5min。（3）轮状病毒G/P分型第一轮PCR体系的配置，共50µl体系，在冰盒上进行,见表5。15 南京医科大学硕士学位论文表5.G/P分型第一轮PCR反应体系VP7(VP4)试剂体积（μl）10mMdNTPs25×buffer10EnzymeMix2RNaseinhibitor0.5H2O25.5变性产物10上述体系配置完成后，瞬时离心，置于PCR仪中进行第一轮扩增，反应程序为：50℃30min→95℃15min→（94℃30sec→42℃30sec→72℃1min）×35→72℃7min→4℃∞。（4）轮状病毒G/P分型第二轮PCR体系的配置，共20µl体系，在冰盒上进行,见表6。表6.G/P分型第二轮PCR反应体系试剂体积（μl）2×Mix10G分型：20µM（aBT1-aAT8,G3,G9）各0.5P分型：20µM(1T1-5T1,P[11])VP7R(VP4F)0.5H2O5.5第一轮产物1上述体系配置完成后，瞬时离心，然后置于PCR仪中进行第二轮扩增，反应程序为：94℃3min→（94℃30sec→42℃30sec→72℃1min）×35→72℃7min→4℃∞。3.4.3琼脂糖凝胶电泳（1）配置1.5%琼脂糖凝胶：用电子天平称取1.5g琼脂糖于锥形瓶中，用量桶量取100ml0.5×TBE液，至微波炉中中火加热2min，待琼脂糖完全溶解至透亮后取出，并加入GoldView核酸染色剂5μl轻轻摇匀；（2）制备胶板：将内槽放入制胶塑料板内，插上加样梳，调至水平，将琼脂糖液缓慢倒入内槽使其慢慢铺开形成均匀的胶层，待其冷却凝固后，缓慢垂直拔去梳子，将胶板和内槽放入电泳仪中，其中电泳液为0.5×TBE液；（3）加样：取3μlPCR产物加入到胶板的加样孔内。并加入DNAMarker作为参照。加样时应注意更换枪头，防止交叉污染；16 南京医科大学硕士学位论文（4）电泳：接通电源，样品由负极向正极泳动，设置电压参数130v电泳时间50min；（5）结果判读：紫外灯下观察并在琼脂糖凝胶成像系统下照相，与DNAmarker的参考条带进行比对，根据特异性核酸条带大小判断RV的G/P型别。G/P各型核酸条带大小见表7和表8。表7.G分型核酸条带G分型大小（bp）G1618G2521G3682G4452G8754G9179表8.P分型核酸条带P分型大小（bp）P[4]362P[6]146P[8]224P[9]270P[10]462P[11]19117 南京医科大学硕士学位论文结果1.苏州地区5岁以下儿童RV腹泻的流行病学特征1.1RV腹泻的性别分布2010.01~2016.12研究期间，苏州地区5岁以下儿童发生腹泻的人数达2658例，其中男性患儿1566例，女性患儿1092例。诊断为RV腹泻的患儿为914例，RV阳性率为34.39%（914/2658）。914例RV腹泻的患儿中，男性患儿567例，女性患儿347例，男女患儿比例为1.63:1。男性患儿的RV阳性率36.21%（567/1566），女性患儿的RV阳性率31.78%（347/1092）。经卡方检验，男女患儿RV腹泻的阳性率没有显著性差异（χ2=5.597，P=0.18）。结果见表9。表9.5岁以下患儿RV腹泻的性别分布性别检测总数RV阳性数RV构成比RV阳性率χ2P男156656762.04%36.21%女109234737.96%31.78%5.5970.18合计2658914100%34.39%1.2RV腹泻的年龄分布2010.01~2016.12研究期间，5岁以下儿童发生RV腹泻的病例主要集中在35月龄以下儿童，共874例，占RV腹泻患儿总数的95.62%（874/914），其中12~17月龄是最主要的发病年龄段，RV阳性数是358例，占总病例数的39.17%（358/914），其次是6~8月龄（15.54%，142/914）和9~11月龄（14.99%，137/914）。根据各年龄段标本检测总数及RV阳性检测数可计算出各年龄段RV阳性率（见表10）。经卡方检验，不同年龄段患儿RV腹泻的阳性率有显著性差异（χ2=130.467，P=0.0001）。表10.5岁以下患儿RV腹泻的年龄分布月龄检测总数RV阳性数RV构成比阳性率χ2P0~2213414.49%19.25%3~5339839.08%24.48%6~848714215.54%29.16%130.4670.00019~1135013714.99%39.14%12~1773035839.17%49.04%18 南京医科大学硕士学位论文18~23152495.36%32.24%24~35211647.00%29.63%36~4787252.73%26.60%48~5989151.64%15.15%合计2658914100.00%34.39%图1可以更直观的反应各年龄段RV腹泻阳性率的变化，0~2月龄儿童RV阳性率较低（19.25%），>2月龄的儿童RV阳性率逐渐升高，12~17月龄儿童RV的阳性率达最高（49.04%），>18月龄以后的儿童RV的阳性率开始下降。图1.5岁以下患儿RV阳性率的年龄分布趋势1.3RV腹泻的时间分布2016.01~2016.12研究期间，全年均有5岁以下儿童发生RV腹泻的病例报道。根据各月份标本检测总数及RV阳性检测数可计算出不同月份RV阳性率。其中RV阳性率最高的月份为1月（70.45%，31/44），其次是2月（64.71%，11/17）和12月（58.14%，25/43），7月RV阳性率最低（0.00%，0/28）。其他各月份RV阳性率见表11。经卡方检验，不同月份患儿RV腹泻的阳性率有显著性差异（χ2=181.426，P=0.0001）。表11.5岁以下患儿RV腹泻的时间分布月份总阳性数检测总数阳性率χ2P1月314470.45%2月111764.71%3月81942.11%181.4260.00014月32015.00%5月32611.54%19 南京医科大学硕士学位论文6月22010.00%7月0280.00%8月1402.50%9月2258.00%10月33010.00%11月173253.13%12月254358.14%合计10634430.81%图2可以更直观的反应出2010.01~2016.12RV感染在苏州地区的分布情况。全年均可检测到RV，但季节性分布特点明显，以秋冬季节（10月~次年2月）阳性率最高，每年的夏季（6~8月）阳性率最低。RV感染高峰期从每年11月开始，持续到次年2月，然后逐渐降低，7月RV阳性率最低。此外，从图2中还可以看出2010.01~2011.01监测期间RV阳性数较少，2011.10~2012.01期间RV阳性数明显增多；而在2014.01~2014.12期间RV阳性数有所减少，RV的阳性数在各年份间呈现交替增减模式。图2.5岁以下患儿RV阳性率的时间变化趋势2.苏州地区儿童RV腹泻的G/P分型分布2.1G基因型分型特征本研究中共914份RV阳性标本，878份标本获得明确的G分型，其余36例未能分型。其中，G9型有559例，占61.16%（559/914），为苏州地区主要的流行G基因型；其次是G1型（15.10%，138/914），G3型（10.39%，95/914），20 南京医科大学硕士学位论文G2型（7.44%，68/914）；另检出4例G4型和14例混合感染（主要以G3+9和G1+9的形式存在）。在2010.01~2016.12研究期间，G9型在各年间均有流行，但从2012年起G9型检出数明显增加，成为苏州地区主要的流行型别，并持续至今。G1型在2010和2011年是优势毒株，从2012年起，G1型明显减少。G4型有4例仅出现在2011年。结果见图3。图3.2010~2016年苏州地区5岁以下儿童RV的G基因型分布2.2P基因型分型特征本研究中共914份RV阳性标本，884份标本获得明确的P分型，其余30例未能分型。P型以P[8]为主，占87.09%（796/914）；其次为P[4]，占7.88%（72/914）；另检出混合感染P[4+8]16例。2010.01~2016.12研究期间，该地区P基因型相对较固定，各年份中P[8]均为优势P基因型，其次是P[4]，未检测出其它P基因型。结果见图4。图4.2010~2016年苏州地区5岁以下儿童RV的P基因型分布2.3G/P组合基因型特征本研究中共914份RV阳性标本，检测出8种主要的G/P组合基因型。其中21 南京医科大学硕士学位论文G9P[8]最为常见，占58.42%（534/914），其次是G1P[8]型（13.46%，123/914）和G3P[8]型(10.61%，97/914)；另检出G2P[4]型38例、G2P[8]型29例、G9P[4]型15例、G1P[4]型11例和G3P[4]型5例；G和（或）P混合感染22例；其余40例未能分型。2010.01~2016.12研究期间，G9P[8]在各个年份均可以检测出，但从2012年起G9P[8]型毒株的数量明显增加，成为苏州地区RV腹泻的主要流行基因型组合。在2010和2011年G1P[8]在各年的阳性率较高，为优势毒株，但从2012年起G1P[8]型毒株显著减少。G3P[8]型毒株在2010年有50例，2011年后逐渐减少。结果见图5。图5.2010~2016年苏州地区5岁以下儿童RV的G/P组合基因型分布22 南京医科大学硕士学位论文讨论腹泻是发展中国家重要的公共卫生问题之一，儿童腹泻尤以病毒性腹泻最为常见，RV是病毒性腹泻的主要病原体之一。2009年43个国家的RV病毒感染调查报告显示，25%~47%的5岁以下的住院儿童检测结果是RV阳性。WHO的研究数据显示，40%的5岁以下RV腹泻的患儿需入院治疗，而由RV感染致死的患儿数可达350000~600000例。本课题研究了2010~2016年苏州地区5岁以下儿童RV腹泻的流行情况，其结果显示RV仍是该地区病毒性腹泻的主要病原体，其阳性率为34.39%（914/2658），该结果与我国许多地区（上海、昆明）的报道相一致[24,25]，但是比北京的调查结果偏高[26]。本研究中共914例RV阳性患儿，男性患儿数明显多于女性，与国内外报道一致，但结果无统计学意义。本研究中RV腹泻发病的主要年龄段是<35月龄，占RV阳性患儿总数的95.62%，尤以12~17月龄儿童RV的阳性率最高，与文献报道基本一致[27]。0~2月龄婴儿RV的阳性率较低，考虑原因是母乳喂养阶段的婴儿由于乳汁中sIgA具有保护作用，可预防RV感染，也可能是因为0~2月龄婴儿体内胎传抗体尚未消失，可抵御RV入侵感染。>36月龄儿童因免疫系统及肠道功能趋向完善，血清及肠道环境中存在针对RV的特异性sIgA，或是既往感染过RV，体内已产生保护性抗体，因而RV阳性率降低。因此，应加强对3~35月龄儿童RV感染的预防工作。RV腹泻在热带地区国家季节性分布不明显，但在温带地区，RV腹泻发病高峰主要在秋冬季节，夏季阳性率最低。本研究中，苏州地区每年RV腹泻的发病高分期在11月至次年2月，5月~8月RV阳性率最低，符合季节性发病规律。RV腹泻季节性分布的机制尚不明确，可能与区域温度及湿度有关。在苏州地区的研究结果显示2010.01~2011.01期间RV阳性患儿较少，2011.10~2012.01期间RV阳性数明显增多；而在2014.01~2014.12期间RV阳性数有所减少，RV的阳性发病数在各年份间呈现交替增减模式。可能的原因的是RV感染的患儿在一次感染后，体内产生了保护性抗体，所以在下一次RV流行高峰期时能够保护机体不受感染。23 南京医科大学硕士学位论文到目前为止，RotaC2.0（http://rotac.regatools.be/）软件通过序列分析已确立有27个G基因型和37个P基因型，全球报道至少有42种G/P组合的RV毒株，但是只有少部分型别的RV毒株能够在人类流行，引起人们发病。G1、G2、G3、G4和G9是全球公认的5种流行G基因型。近年来，关于G12感染的报道有所增加[28,29]。我国RV毒株进行G分型的资料表明，流行毒株主要为G1~G4[11]，与全球的流行趋势基本一致，但也存在差异。1983年美国首次检测出G9型，1996年G9引起全球范围内的广泛流行，我国在1994年首次报道G9基因型，随后在全国各地逐渐出现G9流行，成为我国的优势G基因型。本研究对2010~2016年5岁以下儿童感染的RV进行了G分型，结果显示，G9是苏州地区的最主要G基因型，占61.16%，其次是G1型15.10%，G3型10.39%，G2型7.44%。这与甘肃、北京等地的报道一致[30]，但与广州地区以G1型和G3型为主的结果不同，这提示我国各地RV流行G基因型存在差异。本研究与之前苏州地区2001~2003年报道的流行趋势不同，期间最常见的G基因型为G3（60.49%），其次是G1（22.49%），而G9型极少（0.90%）[31]，说明即使在同一地区不同时间内的流行株也有差别。本研究仅检测出4例G4型，G4型较少出现，与苏州地区往年报道相符。尚有36例未能分型，可能是本研究中存在罕见的G基因型或标本中病毒含量低及标本保存不当致RNA降解等因素有关。P基因型相对较为固定。目前全世界比较流行的P基因型为P[4]、P[6]和P[8]，其他型别少见。我国RV毒株进行P分型的资料表明，流行毒株主要为P[4]和P[8]，与全球的流行趋势一致[11]。本研究对2010~2016年5岁以下儿童感染的RV进行了P分型，结果显示，P[8]型最多见（86.9%），其次为P[4]型（7.9%）。与之前苏州地区报道的结果一致，也与全国的流行趋势相符。P[6]型曾在北京引起暴发；在韩国，P[6]占25%，流行程度仅次于P[8]。但在2010~2016年对苏州儿童腹泻研究期间，未检测到P[6]。30份标本未能P分型，提示可能有少见的其他P基因型存在。全球比较流行的G/P组合基因型为G1P[8]、G2P[4]、G3P[8]、G4P[8]、G9P[8]24 南京医科大学硕士学位论文和G12P[8]，约90%的RV感染与以上6种毒株有关，我国的流行毒株的型别与全球的流行趋势大致相仿。在本次研究中G9P[8]型RV最为常见（58.42%），其次是G1P[8]型（13.46%）和G3P[8]型（10.61%）。与上海、昆明等地区的流行趋势一致[24]。未检测到G4P[8]和G12P[8]。此外还检测到G1P[4]、G2P[8]、G3P[4]及G9P[4]等一些少见的毒株。在2010年和2011年，G1P[8]的阳性率较高，为优势毒株，但从2012年起G1P[8]型毒株显著减少，而G9P[8]则成为苏州地区RV腹泻的主要流行基因型组合。这一结果提示苏州地区RV流行株的多样性，同时也证实了流行株随时间发生改变，即使在同一地区不同年份的流行毒株也可能不同。25 南京医科大学硕士学位论文小结1.RV是引起5岁以下儿童病毒性腹泻的主要病原体。男女患儿RV腹泻的阳性率无显著性差异，12~17月龄是RV感染的主要年龄段；2.RV腹泻全年均可发病，但存在明显的季节性，以秋冬季节阳性率最高。其中，1月RV阳性率最高，2月次之，7月最低；3.2010~2016年研究期间，RV的G基因型以G9为主，P基因型以P[8]为主，G/P组合基因型以G9P[8]型为主要流行株，其次还包括G1P[8]型和G3P[8]型，还存在一些少见的毒株（如：G1P[4]、G2P[8]和G3P[4]等）。RV毒株型别复杂多样，而且一直处于变化中。26 南京医科大学硕士学位论文第二部分2010~2016年流行株G9P[8]的全基因组测序分析利用第一部分成功进行G/P分型的RV腹泻标本，挑选出2010~2016年期间各年份中具有代表性的G9P[8]毒株，每年选取1株，共7株（分别命名为JS2010~JS2016）。利用PCR对7株毒株的11个基因片段进行扩增，并对PCR产物进行测序分析。材料与方法1.实验材料1.1主要试剂试剂名称来源PrimeScriptTMOneStepRT-PCRKitVer.2日本TaKaRaRegularAGAROSEG-10琼脂糖上海玉博GoldViewNucleicAcidStain北京Solarbio5×TBEbuffer上海Sangon6×LoadingBuffer日本TaKaRaDL1500DNAMarker日本TaKaRaQIAquickGelExtractionKit德国QIAGENDEPC水上海生工1.2主要仪器设备设备名称来源梯度PCR仪Veriti美国ABI电泳仪美国BIA-RAD紫外灯箱上海鄂禾恒温混匀仪美国Eppendorf制冰机意大利Scotsman27 南京医科大学硕士学位论文凝胶成像系统美国BIA-RAD生物安全柜美国Baker微量加样器美国Eppendorf高速离心机美国Eppendorf电子天平BS300S-WE1德国Sartorius2.实验方法2.1引物参照GenBank中人RV的11个基因片段核苷酸序列和相关文献[32-34]，设计引物序列见表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。表1.G9P[8]型RV全基因组扩增引物引物序列（5’→3’）VP1-FCGCTATTAAAGCTGTACAATGVP1-RGGTCACATCTAAGCACTCTAAVP2-FGGCTATTAAAGGCTCAATGGCVP2-RGGTCATATCTCCACAGTGGVP3-FGGCTATTAAAGCAGTACYAGTVP3-RGGTCACATCYTGACTAGTGTVP4-FGGCTATAAAATGGCTTCRCTCVP4-RGGTCACATCCTCAATAGCGTTVP6-FGGCTTTAAAACGAAGTCTTCVP6-RGGTCACATCCTCTCACTACATVP7-FGGCTTTAAAAGAGAGAATVP7-RGGTCACATCATACAATTCTAANSP1-FGGCTTTTTTTWTGAAAAGTCTNSP1-RGGTCACACTTTTTTATGCTGCNSP2-FGGCTTTTAAAGCGTCTCAGTCNSP2-RGGTCACATAAGCGCTTTCTATNSP3-FGGCTTTTAATGCTTTTCAGTGGNSP3-RGGTCACATAACGCCCCTATAGNSP4-FGGCTTTTAAAAGTTCTGTTCCNSP4-RGGTCACATTAAGACCYTTCCTNSP5-FGGCTTTWAAAGCGCTACAGTGNSP5-RGGTCACAAAACGGGAGTGG28 南京医科大学硕士学位论文2.2反应体系11个基因片段PCR反应体系的配置，共25μl，在冰盒上进行，见表2。表2.RV全基因组PCR反应体系试剂体积（μl）DEPCH2O5.52×1stepBuffer12.5F端引物0.5R端引物0.5PrimeScriptTM1StepEnzymeMix1RNA模板52.3反应程序各基因片段的反应程序见表3。表3.RV全基因组扩增的反应程序循环数VP1~4基因VP6~7、NSP1~5基因150℃30min50℃30min194℃2min94℃2min35(94℃30s→55℃30s→72℃4min)(94℃30s→55℃30s→72℃2min)172℃7min72℃7min14℃∞4℃∞2.4琼脂糖凝胶电泳（1）配置1.5%琼脂糖凝胶：用电子天平称取1.5g琼脂糖于锥形瓶中，用量桶量取100ml0.5×TBE液，至微波炉中中火加热2min，待琼脂糖完全溶解至透亮后取出，并加入GoldView核酸染色剂5μl轻轻摇匀；（2）制备胶板：将内槽放入制胶塑料板内，插上加样梳，调至水平，将琼脂糖液缓慢倒入内槽使其慢慢铺开形成均匀的胶层，待其冷却凝固后，缓慢垂直拔去梳子，将胶板和内槽放入电泳仪中，其中电泳液为0.5×TBE液；（3）加样：取3μlPCR产物与点样板上的6×LoadingBuffer混匀后加入到胶板的加样孔内。并加入DNAMarker作为参照。加样时应注意更换枪头，防止交29 南京医科大学硕士学位论文叉污染；（4）电泳：接通电源，样品由负极向正极泳动，设置电压参数130v电泳时间50min；（5）结果判读：紫外灯下观察并在琼脂糖凝成像系统下照相，与DNAmarker的参考条带进行比对，根据特异性核酸条带大小判断所扩增的PCR产物是否为目标片段。各基因片段核酸条带大小见表4。表4.RV各基因片段核酸条带基因片段大小（bp）VP13302VP22729VP32591VP42591VP61356VP71062NSP11566NSP21059NSP31074NSP4750NSP56642.5PCR产物的胶体纯化（1）PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯箱下切下PCR扩增片段对应的凝胶，放入1.5ml的EP管（预先称重）中，称取总重量，算出凝胶的质量，根据凝胶的质量，加入3倍体积的bufferQG；（2）50℃孵育10min使凝胶完全溶解并结合DNA，加热过程中每隔2min将EP管拿出颠倒混匀，并检查混合物颜色是否变为淡黄色；（3）加入凝胶质量1倍体积的异丙醇并混匀；（4）将洗脱柱置于2ml已标记的收集管内，加入上述标本混匀液，13000rpm离心1min；（5）弃去洗脱液，加入500μlbufferQG，13000rpm离心1min；（6）弃去洗脱液，加入750μlbufferPE，13000rpm离心1min；30 南京医科大学硕士学位论文（7）弃去洗脱液，13000rpm离心1min（空离）；（8）将洗脱柱置于1.5ml已标记的EP管中，加入20μlbufferEB静置1min后，13000rpm离心1min。此时EP管中的离心液体即为PCR的回收产物。2.6PCR产物的测序将收集到的11个基因片段的PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。2.7序列分析（1）利用RotaC2.0（http://rotac.regatools.be/）对RV的11个基因片段进行分型。（2）将本研究中的序列上传至https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/，通过Blast工具获取同源关系较近RV毒株，以GenBank数据库中的RV毒株序列作为参考序列，应用CLUSTALW软件对本研究中所测的序列和参考序列进行多重比对。（3）应用MEGA5.0软件中最大似然法（maximumlikelihood）绘制各个基因片段的系统进化树。2.8序列注册将本研究中所测得的基因序列上传至GenBank数据库中进行注册。本研究中各片段在GenBank数据库中的注册号分别为：VP1片段的注册号是MF580875-580881；VP2片段的注册号是MF580868-580874；VP3片段的注册号是MF580861-580867；VP4片段的注册号是MF580854-580860；VP6片段的注册号是MF580847-580853；VP7片段的注册号是MF580840-580846；NSP1片段的注册号是MF580910-580916；NSP2片段的注册号是MF580903-580909；NSP3片段的注册号是MF580896-580902；NSP4片段的注册号是MF580889-580895；NSP5片段的注册号是MF580882-580888。本研究中涉及到的参考毒株的Genbank号包括：JX406747-JX406757，KT920679-KT920689，HQ650116-HQ650126，KT919498-KT919508，DQ870501-DQ870504，EF990707-EF990713，KF726044-KF726054，31 南京医科大学硕士学位论文LC105445-LC105455，EF583049-EF583052，EF672619-EF672625，KT007646，KF673484，KC200154，KF673488，AB045374，AY003871，AB176681，D38055，AB091778，AF281044，DQ207390，JQ253563，KF673477，KP752521，AF260959，AJ491181，L14072，KT921061，JN706528，LC066195，KF371854，KF371951，EU679400，EF077355，HQ127436，AB008296，AB008280，AJ302146，GQ869839，AJ302148，U41006，U30716，DQ857924，FJ361204,LC105272，KF371952，KF371941，HM773738，HM534677，HQ609561，JX195089，KT920688，EU979380，EU679385，JX195067，EF426119，HQ391996，HQ392274，JN258906，FJ361206,JQ069850，KF371775，KT988200，JN258932，KF371885，KF371863，KT920685，JN605449，JN258911，HM773758，HM773591，HQ392308，EF583048，FJ361202，EF583030，JQ993322，KF371950，JQ069757，KF372016，KT920686，LC105472，JN013991，HM534674，JN887810，HM773636，DQ146673，FJ361203，EF560623，AY277921，JQ993323,KU738596，GU199505，GU199494，KF371950，JQ069757，KF372016，KT920686，LC105472，JN013991，HM534674，JN887810，HM773636，DQ146673，FJ361203，EF560623，AY277921，JQ993323,KU738596，GU199505，GU199494，KU243405，KU243426，KF371869，JN887816，HM348720，KC443484，HM773641，FJ361208，EF990696，JN605444，JF796719，KF371771，KF371923，JQ069268，LC105211，JX027861，JN706641，HM773596，HQ657157，JN605456，KF372012，KF371882，KF371935，HQ6577158，JN605435，JF689836，JN605413，HM773632，FJ361210，JN258904，KF371947，JN258926，FJ794019，HM773633，JN258903，KT920683，EU753967，JQ993328，FJ361211，AY033396，KT920679，JN258925，JQ069440，KU243384，KU243378，JF766584，JN605432，HQ1127389，FJ361205，JX027866。32 南京医科大学硕士学位论文结果1.G9P[8]全基因组分型7株G9P[8]型RV毒株（JS2010~JS2016）和部分参考毒株的各基因片段的长度及分型结果见表5。7株毒株的全基因组分型结果均为G9-P[8]-I1-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E1-H1，属于RV的Wa-like基因组。表5.流行株的全基因组分型特征带”●”标记的毒株为本研究中的7株毒株，其余为GenBank数据库中的参考毒株。在系统进化树中属于同一进化支的毒株序列用同一颜色标记，灰色标记的序列表示与表格中相应的基因片段都不在同一个进化支。DS-1毒株作为本研究中的外群参考株。2.G9P[8]型RV的11个基因片段的分析将本研究中的序列上传至https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/，通过Blast工具发现所有序列均和人RV毒株同源性更高，与动物源型RV毒株的同源性较低。选取GenBank数据库中国内外近年来和以往较为流行的RV毒株作为参考毒株，与本研究中的7株G9P[8]毒株（JS2010~JS2016）的11个基因片段进行比对并做系统进化分析。2.1VP7基因片段的系统进化分析根据VP7基因片段的核苷酸序列分析，G9型RV毒株可以分为6个分支，分别为I~VI。本研究中的7株毒株分属在2个分支（见图1），其核苷酸同源性为90.75%~99.90%。其中，苏州地区早期的G9流行株JS2010和JS2011属于G9-III分支，这2个毒株间的核苷酸同源性为99.59%。此外，非洲株33 南京医科大学硕士学位论文MRC-DPRU5123和韩国株CAU08-463和中国株BJ-Q33（均为G9P[8]）也属于G9-III分支，与JS2010和JS2011的亲缘关系较近，其核苷酸同源性为99.17%~99.49%。另外5株G9毒株JS2012~JS2016属于G9-VI分支，这5个毒株间的核苷酸同源性为99.18%~99.90%。上海株SPH0144、北京株BJ-Q1141、美国株VU12-13-101及日本株UR14-17（均为G9P[8]）均属于该分支，其与JS2012~JS2016毒株核苷酸同源性为98.73%~99.89%。北京株BJ-Q1141（G9P[8]）与JS2013及JS2014的亲缘关系近，JS2015及JS2016则与上海株SPH0144（G9P[8]）亲缘关系更近。所有毒株的VP7基因片段与疫苗株LLR相距较远。34 南京医科大学硕士学位论文CU-B1670RVA/Hu/Thailand/2012/G9P[8]/KT007646JS2014Hu/China/2014UR14-17RVA/Hu/Japan/2014/G9P[8]/LC105445JS2012Hu/China/2012BJ-Q1141RVA/Hu/China/2012/G9P[8]/KF673484JS2013Hu/China/2013SPH0144RVA/Hu/China/2011/G9P[8]/KC200154VI100JS2016Hu/China/2016BJ-CR7818RVA/Hu/China/2012/G9P[8]/KF673488JS2015Hu/China/2015VU12-13-101RVA/Hu/USA/2013/G9P[8]/KT919508K-1RVA/Hu/Japan/1995/AB045374T203RVA/Hu/China/1997/AY00387198JP29-6RVA/Pro/Japan/2002/AB176681G9Mc345RVA/Hu/Thailand/1989/D3805598684VNRVA/Hu/Vietnam/1999/G9P[8]/AB091778CIT-254RVRVA/Hu/Ireland/1997/AF2810449617025-03RVA/Hu/Irelad/2003/DQ207390B3458RVA/Hu/Belgium/2003/G9P[8]/EF990708III100CAU08-463RVA/Hu/Korea/2008/G9P[8]/JQ25356398BJ-Q33RVA/Hu/China/2010/G9P[8]/KF673477MRC-DPRU5123RVA/Hu/Togo/2010/G9P[8]/KP752521JS2010Hu/China/2010JS2011Hu/China/201180WI61RVA/Hu/US/1983/G9P[8]/AB180969I9297'SZ37RVA/Hu/China/1997/G9/AF260959IVOM46RVA/Hu/USA/1997/G9P[8]/AJ491181V116ERVA/Hu/India/1986/G9P[11]/L14072IILLRLamb/China/1985/HM800948DS-1RVA/Hu/USA/1976/G2P[4]/AB118023G2E2484RVA/Hu/China/2011/G4P[8]/KF726044G4100CNMC125RVA/Hu/USA/2011/G1P[8]/KT920689G1WaRVA/Hu/USA/1974/G1P[8]/KT6949440.05图1.RV的VP7基因核苷酸序列进化分析利用MEGA5.0软件将7株G9P[8]毒株的VP7基因的核苷酸序列翻译成氨基酸序列，并与G9的原型株WI61的氨基酸序列进行比对，在其可变区（variableregions，VRs）[35]检测到有多位点发生氨基酸变异，见表6：VR1有V9I、I17V；VR3有V44A,L;VR4有T65A、L73Q、D74E；VR5有A87T、D100N；VR7有Y144H；VR8有T208I、A220T、S221G,N；VR9有T242N。相应的抗原决定区也检测出氨基酸突变：在D抗原区有T65A、L73Q、D74E；在A抗原区有A87T、35 南京医科大学硕士学位论文D100N；在B抗原区有Y144H；在C抗原区有T208I、A220T、S221G,N；在F抗原区有T242N。而JS2010和JS2011与近年来流行的G9-III参考株的氨基酸序列比对时，仅有T65A和S221G两个位点发生变异，JS2012~JS2016与近年来流行的G9-VI参考株的氨基酸序列比对时，仅221位点的氨基酸处于波动中。表6.G9型RV的VP7基因氨基酸序列差异比较2.2VP4基因片段的系统进化分析根据VP4基因片段的核苷酸序列分析，P[8]型RV毒株可以分为4个分支，分别为1~4。本研究中的7株毒株分属在2个分支（见图2），其核苷酸同源性为84.93%~99.60%。其中有6株毒株属于P[8]-3分支，亲缘关系较近，核苷酸序列的同源性为98.33%~99.60%。美国株CNMC125（G1P[8]）、日本株14-17（G9P[8]）、武汉株E2484（G4P[8]）、河北株L1450（G3P[8]）及P[8]的原型株B3458（G9P[8]）均属于P[8]-3分支。但以上6株毒株在不同的小的分支里。进化树结果显示，JS2010、JS2011和JS2013在同一个小的分支里，与武汉株E2484（G4P[8]）和河北株L1450（G3P[8]）的进化关系近，其核苷酸序列的同源性为99.48%~99.60%。JS2014~JS2016属于另一个小的分支，与美国株CNMC125（G1P[8]）和日本株UR14-17（G9P[8]）的同源性更高，其核苷酸同源性为99.16%~99.60%。JS2012毒株属于P[8]-4分支，与非洲株MRC-DPRU5123（G9P[8]）36 南京医科大学硕士学位论文的核苷酸同源性为100%，与P[8]原型株B3458的进化关系较远。7株毒株距离疫苗株LLR的亲缘关系很远。JS2014RVA/Hu/China/2014/G9P[8]CNMC125RVA/Hu/USA/2011/G1P[8]/KT92068789CNMC112RVA/Hu/USA/2011/G1P[8]/KT921061JS2015RVA/Hu/China/2015/G9P[8]JS2016RVA/Hu/China/2016/G9P[8]UR14-17RVA/Hu/Japan/2014/G9P[8]/LC105446CU769-KKRVA/Hu/Thailand/2010/G1P[8]/JN70652887SP118RVA/Hu/Vietnam/2013/G1P[8]/LC066195E2432RVA/Hu/China/2010/G3P[8]/KF37185493JS2010RVA/Hu/China/2010/G9P[8]P[8]-3JS2011RVA/Hu/China/2011/G9P[8]E2484RVA/Hu/China/2011/G4P[8]/KF726045JS2013RVA/Hu/China/2013/G9P[8]L1450RVA/Hu/China/2012/G3P[8]/KF3719519681CAU219RVA/Hu/Korea/2008/G1P[8]/EU679400VU12-13-101RVA/Hu/USA/2013/G9P[8]/KT919506P[8]B3458RVA/Hu/Belgium/2003/G9P[8]/EF990707KMR787RVA/Hu/Korea/2000/EF077355Om67RVA/Hu/USA/1998/G9P[8]/HQ127436OdeliaRVA/Hu/1997/G4P[8]/AB00829699WaRVA/Hu/USA/1974/G1P[8]/KT694942P[8]-1ITORVA/Hu/1997/G3P[8]/AB0082808299JS2012RVA/Hu/China/2012/G9P[8]88MRC-DPRU5123RVA/Hu/Togo/2010/G9P[8]/KP752519100MW670RVA/Hu/Malawi/2000/AJ302146P[8]-4MMC153RVA/Hu/Bangladesh/2006/G9P[8]/GQ869839OP354RVA/Hu/Malawi/2000/AJ30214899H8RVA/Hu/Brazil/1995/G5P[8]/U41006F45RVA/Hu/Japan/1987/G9P[8]/U30716P[8]-2rj35400RVA/Hu/Brazil/1987/G5P[8]/DQ857924WI61RVA/Hu/USA/1983/G9P[8]/EF672619DS-1RVA/Hu/USA/1976/G2P[4]/EF672577P[4]LLRLamb/China/1985/JQ013506116ERVA/Hu/India/1986/G9P[11]/FJ361204P[11]0.05图2.RV的VP4基因核苷酸序列进化分析利用MEGA5.0软件将7株G9P[8]毒株的VP4基因的核苷酸序列翻译成氨基酸序列，并与P[8]原型株B3458的氨基酸序列进行比对，可检测到有多位点发生氨基酸变异，见表7：T78S,K、I91V、D153N、T245K、F587V,I、S608A和R651G。而本研究中的6株毒株（JS2010~JS2011，JS2013~JS2016）与近年来37 南京医科大学硕士学位论文流行的P[8]-3毒株氨基酸序列进行比对时，各位点的氨基酸较为稳定，没有出现新的变异，JS2012与近期流行的P[8]-4的毒株氨基酸序列比对时，各位点也没有出现新的氨基酸变异。有报道称VP4基因片段中有6个多肽序列(aa1~10、aa35~44、aa55~66、aa223~234、aa296~313及aa381~401)与交叉反应的中和抗原表位有关。本研究7株毒株的VP4片段的氨基酸序列中在上述位点未检测到氨基酸变异。表7.P[8]型RV的VP4基因氨基酸序列差异比较2.3VP6基因片段的系统进化分析根据VP6基因片段的核苷酸序列分析，RV毒株目前已知有16个I基因型分别为I1~I16。本研究中的7株毒株分属在同一个分支I1（见图3），其核苷酸序列的同源性是99.49%~100%。但这7株毒株分属在两个小分支里。其中JS2012和JS2015属于同一个小分支，与2013的武汉株L1621、L1450（均为G3P[8]）亲缘关系较近，其核苷酸同源性为99.32%~99.58%。其他5株毒株则与2014年的日本株To14-18（G9P[8]）来源于同一分支，核苷酸同源性为99.58%~99.66%。美国株VU12-13-101、WI61及意大利株AV21虽然均为G9P[8]型，但进化关系较远，其核苷酸同源性为95.39%~96.50%。7株毒株的VP6基因片段与疫苗株LLR的遗传距离较远。38 南京医科大学硕士学位论文JS2013RVA/Hu/China/2013/G9P[8]To14-18RVA/Hu/Japan/2014/G9P[8]/LC105272JS2016RVA/Hu/China/2016/G9P[8]80JS2010RVA/Hu/China/2010/G9P[8]JS2014RVA/Hu/China/2014/G9P[8]JS2011RVA/Hu/China/2011/G9P[8]L1450RVA/Hu/China/2012/G3P[8]/KF371952JS2012RVA/Hu/China/2012/G9P[8]92JS2015RVA/Hu/China/2015/G9P[8]95L1621RVA/Hu/China/2013/G3P[8]/KF3719412008747322RVA/Hu/USA/2008/G3P[8]/HM773738MRC-DPRU5123RVA/Hu/Togo/2010/G9P[8]/KP752520972009727093RVA/Hu/USA/2009/G9P[8]/HM534677B3458RVA/Hu/Belgium/2003/G9P[8]/DQ8705041006361RVA/Hu/India/2006/G1P[8]/HQ609561I1JES11RVA/Hu/Italy/2010/G9P[8]/JX195089100UR14-17RVA/Hu/Japan/2014/G9P[8]/LC10544798CNMC125RVA/Hu/USA/2011/G1P[8]/KT920688100E2484RVA/Hu/China/2011/G4P[8]/KF726046VU12-13-101RVA/Hu/USA/2013/G9P[8]/KT919507100MMC38RVA/Hu/Bangladesh/2005/G9P[8]/EU979380100CAU163RVA/Hu/Korea/2008/G1P[8]/EU679385AV21RVA/Hu/Italy/2010/G9P[8]/JX195067WI61RVA/Hu/USA/1983/G9P[8]/EF58305282US0408RVA/Hu/US/1998/G4P[8]/EF426119100BE00003RVA/Hu/Belgium/2004/G9P[8]/HQ3919969110099BE00032RVA/Hu/Belgium/2008/G1P[8]/HQ392274BE00094RVA/Hu/Belgium/2009/G1P[8]/JN258906116ERVA/Hu/India/1985/G9P[11]/FJ361206WaRVA/Hu/USA/1974/G1P[8]/KT694943DS-1RVA/Hu/USA/1976/G2P[4]/HQ650121I2LLRLamb/China/1985/JQ0311500.05图3.RV的VP6基因核苷酸序列进化分析2.4VP1基因片段的系统进化分析根据VP1基因片段的核苷酸序列分析，RV毒株目前已知有9个R基因型分39 南京医科大学硕士学位论文别为R1~R9。本研究中的7株毒株分属在同一个分支R1（见图4），其核苷酸同源性为97.99%~99.78%。这7株毒株分属在两个小分支里。其中JS2010~JS2012亲缘关系较近，在同一个小分支里，与非洲株MRC-DPRU5123和美国株VU12-13-101（均为G9P[8]）进化关系很近。武汉株E2484（G4P[8]）、L1450（G3P[8]）也属于同一分支。JS2013~JS2016属于另一个小分支，与美国株CK00095及CNMC125（均为G1P[8]）、日本株UR14-17（G9P[8]）相距较近。虽然非洲株MRC-DPRU1424、美国株2009747051及WI61均为G9P[8]型，但距离本研究中的7株毒株较远。7株毒株的VP1基因片段与疫苗株LLR的亲缘关系较远。JS2010RVA/Hu/China/2010/G9P[8]92JS2012RVA/Hu/China/2012/G9P[8]94JS2011RVA/Hu/China/2011/G9P[8]L1450RVA/Hu/China/2012/G3P[8]/KF37194895E2484RVA/Hu/China/2011/G4P[8]/KF72604781MRC-DPRU5123RVA/Hu/Togo/2010/G9P[8]/KP75251699BE00098RVA/Hu/Belgium/2009/G1P[8]/JN25892382B3458RVA/Hu/Belgium/2003/G9P[8]/DQ870501VU12-13-101RVA/Hu/USA/2013/G9P[8]/KT91950394CK00095RVA/Hu/Australia/2010/G1P[8]/JX027930100UR14-17RVA/Hu/Japan/2014/G9P[8]/LC105448CNMC125RVA/Hu/USA/2011/G1P[8]/KT92068498R1100L1621RVA/Hu/China/2013/G3P[8]/KF371937100100E3239RVA/Hu/China/2012/G3P[8]/KF371884JS2016RVA/Hu/China/2016/G9P[8]99JS2015RVA/Hu/China/2015/G9P[8]80JS2013RVA/Hu/China/2013/G9P[8]100JS2014RVA/Hu/China/2014/G9P[8]2009727051RVA/Hu/USA/2009/G9P[8]/HM773623MRC-DPRU1424RVA/Hu/Cameroon/2009/G9P[8]/JN605404100WaRVA/Hu/USA/1974/G1P[8]/DQ490539WI61RVA/Hu/USA/1983/G9P[8]/EF583049100KTM368RVA/Hu/Nepal/2004/G11P[25]/GU199492PRG9121RVA/Por/Korea/2006/G9P[7]/JF796734100DS-1RVA/Hu/USA/1976/G2P[4]/DQ870505R2LLRLamb/China/1985/JQ0135020.05图4.RV的VP1基因核苷酸序列进化分析2.5VP2基因片段的系统进化分析根据VP2基因片段的核苷酸序列分析，RV毒株目前已知有9个C基因型，40 南京医科大学硕士学位论文分别为C1~C9。本研究中的7株毒株分属在同一个分支C1（见图5），其核苷酸同源性为98.18%~99.77%。本研究中7株毒株分属在两个小分支里。JS2012、JS2014和JS2015在同一个分支里，与G3P[8]型的武汉株E3239、G1P[8]型的美国株CNMC125和G9P[8]型的日本株UR14-17的距离较近。其余4株毒株亲缘关系较近，与武汉株E2484（G4P[8]）、E956（G3P[8]），非洲株BE00098（G1P[8]），美国株VU12-13-101（G9P[8]）在同一个小的分支。本研究的毒株与非洲株MRC-DPRU2427及美国株200927036（均为G9P[8]）相距较远。7株毒株VP2基因距离疫苗株LLR较远。JS2011RVA/Hu/China/2011/G9P[8]95JS2013RVA/Hu/China/2013/G9P[8]99JS2016RVA/Hu/China/2016/G9P[8]JS2010RVA/Hu/China/2010/G9P[8]E2484RVA/Hu/China/2011/G4P[8]/KF726048VU12-13-101RVA/Hu/USA/2013/G9P[8]/KT919504RT004-09RVA/Hu/Canada/2009/G3P[8]/JQ06985084E956RVA/Hu/China/2008/G3P[8]/KF37177597PR781RVA/Hu/Italy/2009/G3P[8]/KT988200BE00098RVA/Hu/Belgium/2009/G1P[8]/JN25893294MRC-DPRU5123RVA/Hu/Togo/2010/G9P[8]/KP752517JS2014RVA/Hu/China/2014/G9P[8]93JS2015RVA/Hu/China/2015/G9P[8]JS2012RVA/Hu/China/2012/G9P[8]100E3239RVA/Hu/China/2012/G3P[8]/KF37188581C1UR14-17RVA/Hu/Japan/2014/G9P[8]/LC10544989E2461RVA/Hu/China/2011/G3P[8]/KF371863CNMC125RVA/Hu/USA/2011/G1P[8]/KT920685MRC-DPRU2427RVA/Hu/Kenya/2010/G9P[8]/JN605449100B3458RVA/Hu/Belgium/2003/G9P[8]/DQ870502BE00094RVA/Hu/Belgium/2009/G1P[8]/JN258911902007719739RVA/Hu/USA/2007/G1P[8]/HM7737561001002009727036RVA/Hu/USA/2009/G9P[8]/HM773591BE00035RVA/Hu/Belgium/2008/G1P[8]/HQ39230810098WI61RVA/Hu/USA/1983/G9P[8]/EF583050ST3RVA/Hu/UK/1975/G4P[6]/EF58304610097116ERVA/Hu/India/1985/G9P[11]/FJ361202WaRVA/Hu/1989/G1P[8]/X1494297IAL28RVA/Hu/Brazil/1992/G5P[8]/EF583030BE2001RVA/Hu/Belgium/2009/G9P[6]/JQ993322DS-1RVA/Hu/USA//1976/G2P[4]/HQ650117C2LLRLamb/China/1985/JQ0135030.05图5.RV的VP2基因核苷酸序列进化分析41 南京医科大学硕士学位论文2.6VP3基因片段的系统进化分析根据VP3基因片段的核苷酸序列分析，RV毒株目前已知有8个M基因型，分别为M1~M8。本研究中的7株毒株分属在同一个分支M1（见图6），其核苷酸同源性为97.66%~99.39%。但这7株毒株分别在两个小分支里。JS2013和JS2014与美国株CNMC125（G1P[8]）、日本株UR14-19（G9P[8]）及武汉株Z1602（G3P[8]）亲缘关系较近，在同一个小分支中。其余5株毒株与美国株VU12-13-101（G9P[8]）、武汉株L1450（G3P[8]）、E2484（G4P[8]）相距较近。美国株2009727093和印度株S3也是G9P[8]型毒株，但与本研究中毒株的亲缘关系都比较远。7株毒株的VP3基因片段与疫苗株LLR相距较远。JS2011RVA/Hu/China/2011/G9P[8]94JS2012RVA/Hu/China/2012/G9P[8]JS2010RVA/Hu/China/2010/G9P[8]L1450RVA/Hu/China/2012/G3P[8]/KF371950E2484RVA/Hu/China/2011/G4P[8]/KF726049JS2015RVA/Hu/China/2015/G9P[8]JS2016RVA/Hu/China/2016/G9P[8]99RT172-07RVA/Hu/Canada/2008/G1P[8]/JQ06975799VU12-13-101RVA/Hu/USA/2013/G9P[8]/KT919505Z1602RVA/Hu/China/2012/G3P[8]/KF372016100CNMC125RVA/Hu/USA/2011/G1P[8]/KT92068688JS2013RVA/Hu/China/2013/G9P[8]86JS2014RVA/Hu/China/2014/G9P[8]100UR14-19RVA/Hu/Japan/2014/G9P[8]/LC105472B3458RVA/Hu/Belgium/2003/G9P[8]/DQ870503M12371WCRVA/Hu/Africa/2008/G9P[8]/JN013991992009727093RVA/Hu/USA/2009/G9P[8]/HM534674100CI-81RVA/Hu/Korea/2011/G1P[8]/JN887810982008747307RVA/Hu/USA/2008/G9P[8]/HM773636Matlab13RVA/Hu/Bangladesh/2003/G12P[6]/DQ146673100WI61RVA/Hu/USA/1983/G9P[8]/EF583051WaRVA/Hu/2003/G1P[8]/AY267335116ERVA/Hu/USA/1974/G9P[11]/FJ361203100A253RVA/Pro/Venezuela/1988/G11P[7]/EF56062391OSURVA/Por/2003/AY277921BE2001RVA/Hu/Belgium/2009/G9P[6]/JQ993323S3/NIV1118295RVA/Hu/India/2011/G9P[8]/KU73859610099Matlab36RVA/Hu/Bangladesh/2002/G11P[8]/GU199505KTM368RVA/Hu/Nepal/2004/G11P[25]/GU199494100DS-1RVA/Hu/USA/1976/G2P[4]/HQ650118M2LLRLamb/China/1985/JQ0135040.05图6.RV的VP3基因核苷酸序列进化分析42 南京医科大学硕士学位论文2.7NSP1基因片段的系统进化分析根据NSP1基因片段的核苷酸序列分析，RV毒株目前已知有18个A基因型，分别为A1~A18。本研究中的7株毒株分属在同一个分支A1（见图7），其核苷酸同源性为96.39%~99.14%。本研究中的毒株与美国株CNMC125（G1P[8]）、日本株UR14-17（G9P[8]）、北京株WZ223（G3P[8]）及WZ810（G9P[8]）、韩国株CAU09-371（G9P[8]）进化关系较近，与美国株OM473和非洲株MRC-DPRU5123等一些G9P[8]型毒株的相距较远，与疫苗株LLR的亲缘关系较远。JS2010RVA/Hu/China/2010/G9P[8]JS2012RVA/Hu/China/2012/G9P[8]96CNMC125RVA/Hu/USA/2011/G1P[8]/KT920679JS2015RVA/Hu/China/2015/G9P[8]UR14-17RVA/Hu/Japan/2014/G9P[8]/LC105451BE00098RVA/Hu/Belgium/2009/G1P[8]/JN258925RT017-09RVA/Hu/Canada/2009/G3P[8]/JQ06944091JS2011RVA/Hu/China/2011/G9P[8]84JS2016RVA/Hu/China/2016/G9P[8]92JS2014RVA/Hu/China/2014/G9P[8]WZ223RVA/Hu/China/2013/G3P[8]/KU24338492JS2013RVA/Hu/China/2013/G9P[8]A1WZ810RVA/Hu/China/2013/G9P[8]/KU243378CAU09-371RVA/Hu/Korea/2009/G9P[8]/JF766584100MRC-DPRU4677RVA/Hu/Africa/2010/G9P[8]/JN605432B3458RVA/Hu/Belgium/2003/G9P[8]/EF990709VU12-13-101RVA/Hu/USA/2013/G9P[8]/KT91949899WI61RVA/Hu/USA/1983/G9P[8]/EF672620WaRVA/Hu/USA/1974/G1P[8]/KT69494599Om473RVA/Hu/USA/2000/G9P[8]/HQ127389116ERVA/Hu/India/1985/G9P[11]/FJ361205E2484RVA/Hu/China/2011/G4P[8]/KF72605010081CK00087RVA/Hu/Australia/2009/G1P[8]JX027866MRC-DPRU5123RVA/Hu/Togo/2010/G9P[8]/KP752511DS-1RVA/Hu/USA/1976/G2P[4]/HQ650120A2LLRLamb/China/1985/JQ0311450.05图7.RV的NSP1基因核苷酸序列进化分析43 南京医科大学硕士学位论文2.8NSP2基因片段的系统进化分析根据NSP2基因片段的核苷酸序列分析，RV毒株目前已知有9个C基因型，分别为C1~C9。本研究中的7株毒株分属在同一个分支C1（见图8），其核苷酸同源性为98.85%~100%。本研究中的毒株与2013年的武汉株WZ810（G9P[8]）、WZ220（G3P[8]）及非洲株MRC-DPRU5123（G9P[8]）均属于同一个分支，而与美国株VU12-13-101和日本株UR14-14（均为G9P[8]型）不在同一个小分支里。而且所有毒株均与疫苗株LLR距离较远。JS2011RVA/Hu/China/2011/G9P[8]JS2015RVA/Hu/China/2015/G9P[8]80JS2013RVA/Hu/China/2013/G9P[8]WZ810RVA/Hu/China/2013/G9P[8]/KU243405JS2010RVA/Hu/China/2010/G9P[8]MRC-DPRU5123RVA/Hu/Togo/2010/G9P[8]/KP752512WZ220RVA/Hu/China/2013/G3P[8]/KU24342698JS2012RVA/Hu/China/2012/G9P[8]E2835RVA/Hu/China/2011/G3P[8]/KF37186989JS2014RVA/Hu/China/2014/G9P[8]JS2016RVA/Hu/China/2016/G9P[8]E2484RVA/Hu/China/2011/G4P[8]/KF72605199VU12-13-101RVA/Hu/USA/2013/G9P[8]/KT919499CIUR14-17RVA/Hu/Japan/2014/G9P[8]/LC105452CNMC125RVA/Hu/USA/2011/G1P[8]/KT920680CI-81RVA/Hu/Korea/2011/G1P[8]/JN88781688mani-97/06RVA/Hu/India/2010/HM34872099CK20043RVA/Hu/Australia/2010/G1P[8]/KC4434842008747307RVA/Hu/USA/2008/G9P[8]/HM773641100116ERVA/Hu/India/1985/G9P[11]/FJ361208100WI61RVA/Hu/USA/1983/G9P[8]/EF672622WaRVA/Hu/USA/1974/G1P[8]/KT694946A253RVA/Pro/Venezuela/1988/G11P[7]/EF99069684MRC-DPRU9317RVA/Hu/Africa/2009/G9P[6]/JN605444B3458RVA/Hu/Belgium/2003/G9P[8]/EF990710PRG942RVA/Hu/Korea/2006/G9P[23]/JF796719100DS-1RVA/Hu/USA/1976/G2P[4]/HQ650123C2LLRLamb/China/1985/JQ0311470.05图8.RV的NSP2基因核苷酸序列进化分析44 南京医科大学硕士学位论文2.9NSP3基因片段的系统进化分析根据NSP3基因片段的核苷酸序列分析，RV毒株目前已知有12个T基因型,分别为T1~T12。本研究中的7株毒株分属在同一个分支T1（见图9），其核苷酸同源性为98.30%~100%。本研究中的毒株与武汉株E2484（G4P[8]）、R1267（G3P[8]）及日本株MU14-19（G1P[8]）同属于一个分支，而与非洲株MRC-DPRU2427、美国株VU12-13-101及日本株UR14-17（均为G9P[8]型）的距离较远。而与疫苗株LLR的同源性较低。JS2014RVA/Hu/China/2014/G9P[8]JS2016RVA/Hu/China/2016/G9P[8]97JS2012RVA/Hu/China/2012/G9P[8]92JS2011RVA/Hu/China/2011/G9P[8]E2484RVA/Hu/China/2011/G4P[8]/KF726052E956RVA/Hu/China/2008/G3P[8]/KF371771R1267RVA/Hu/China/2006/G3P[8]/KF371923JS2010RVA/Hu/China/2010/G9P[8]86JS2013RVA/Hu/China/2013/G9P[8]JS2015RVA/Hu/China/2015/G9P[8]RT004-09RVA/Hu/Canada/2009/G3P[8]/JQ069268MU14-19RVA/Hu/Japan/2014/G1P[8]/LC105211T194MRC-DPRU5123RVA/Hu/Togo/2010/G9P[8]/KP75251390CK00087RVA/Hu/Australia/2009/G1P[8]/JX027861CU957-KKRVA/Hu/Thailand/2011/G1P[8]/JN70664191982009727036RVA/Hu/USA/2009/G9P[8]/HM773596B3458RVA/Hu/Belgium/2003/G9P[8]/EF9907111003176WCRVA/Hu/Africa/2009/G12P[6]/HQ657157WI61RVA/Hu/USA/1983/G9P[8]/EF672621WaRVA/Hu/USA/1974/G1P[8]/KT694947MRC-DPRU2427RVA/Hu/Kenya/2010/G9P[8]/JN60545699CNMC125RVA/Hu/USA/2011/G1P[8]/KT92068110080UR14-17RVA/Hu/Japan/2014/G9P[8]/LC105453VU12-13-101RVA/Hu/USA/2013/G9P[8]/KT919500LLRLamb/China/1985/JQ031146DS-1RVA/Hu/USA/1976/G2P[4]/EF136660T20.05图9.RV的NSP3基因核苷酸序列进化分析45 南京医科大学硕士学位论文2.10NSP4基因片段的系统进化分析根据NSP4基因片段的核苷酸序列分析，RV毒株目前已知有15个E基因型，分别为E1~E15。本研究中的7株毒株分属在同一个分支E1（见图10），其核苷酸同源性为98.28%~100%。7株毒株与武汉株Z1602（G3P[8]）、日本株UR14–17（G9P[8]）和美国株VU12-13-101（G9P[8]）在一个分支中，其核苷酸同源性为98.14%~100%。而与非洲株B3458和美国株WI61等G9P[8]型的亲缘关系较远。所有毒株与疫苗株LLR的距离较远。JS2013RVA/Hu/China/2013/G9P[8]NMC125RVA/Hu/USA/2011/G1P[8]/KT920682JS2014RVA/Hu/China/2014/G9P[8]UR14-17RVA/Hu/Japan/2014/G9P[8]/LC10545489JS2015RVA/Hu/China/2015/G9P[8]Z1602RVA/Hu/China/2012/G3P[8]/KF37201296JS2011RVA/Hu/China/2011/G9P[8]JS2012RVA/Hu/China/2012/G9P[8]JS2010RVA/Hu/China/2010/G9P[8]83JS2016RVA/Hu/China/2016/G9P[8]MRC-DPRU5123RVA/Hu/Togo/2010/G9P[8]/KP752514E3239RVA/Hu/China/2012/G3P[8]/KF37188287VU12-13-101RVA/Hu/USA/2013/G9P[8]/KT919501E1L1621RVA/Hu/China/2013/G3P[8]/KF3719353176WCRVA/Hu/Africa/2009/G112P[6]/HQ65715896MRC-DPRU4677RVA/Hu/Africa/2010/G9P[8]/JN605435UKD10RVA/Bov/India/2009/JF6898369794MRC-DPRU1424RVA/Hu/Cameroon/2009/G9P[8]/JN6054132009727051RVA/Hu/USA/2009/G9P[8]/HM7736329910089E2484RVA/Hu/China/2011/G4P[8]/KF726053VU11-12-60RVA/Hu/USA/2012/G3P[8]/KT919060B3458RVA/Hu/Belgium/2003/G9P[8]/EF990712116ERVA/Hu/India/1985/G9P[11]/FJ36121092WI61RVA/Hu/USA/1983/G9P[8]/EF672624BE00094RVA/Hu/Belgium/2009/G1P[8]/JN258904WaRVA/Hu/USA/1974/G1P[8]/KT694948DS-1RVA/Hu/USA/1976/G2P[4]/HQ650125E2LLRLamb/China/1985/JQ0311480.05图10.RV的NSP4基因核苷酸序列进化分析46 南京医科大学硕士学位论文以往的研究报道称在NSP4基因中有4个抗原位点（antigenicsites，AS），分别为ASI（aa151~169），ASII（aa136~150），ASIII（aa112~133）和ASIV（aa1~24）[36]。以Wa株作为参考株，本研究中的毒株在以下位点检测到有氨基酸变异（见表8）：ASI区有I153V、S161N、S169I；ASII区有V141I、I142V、S145T。表8.E1型RV的NSP4基因氨基酸序列差异比较2.11NSP5基因片段的系统进化分析根据NSP5基因片段的核苷酸序列分析，RV毒株目前已知有11个H基因型，分别为H1~H11。本研究中的7株毒株分属在同一个分支H1（见图11），其核苷酸序列的同源性为98.43%~100%。7株毒株与武汉株L1450（G3P[8]）、美国株VU12-13-101（G9P[8]）和非洲株BE00098（G1P[8]）的亲缘关系较近，而与日本株UR14-17（G9P[8]）的距离较远。所有毒株的NSP5的基因核苷酸序列与RV的疫苗株LLR的亲缘关系较远。47 南京医科大学硕士学位论文JS2010RVA/Hu/China/2010/G9P[8]L1450RVA/Hu/China/2012/G3P[8]/KF371947JS2011RVA/Hu/China/2011/G9P[8]E2484RVA/Hu/China/2011/G4P[8]/KF72605485JS2013RVA/Hu/China/2013/G9P[8]JS2014RVA/Hu/China/2014/G9P[8]MRC-DPRU5123RVA/Hu/Togo/2010/G9P[8]/KP75251586B3458RVA/Hu/Belgium/2003/G9P[8]/EF990713VU12-13-101RVA/Hu/USA/2013/G9P[8]/KT919502JS2016RVA/Hu/China/2016/G9P[8]BE00098RVA/Hu/Belgium/2009/G1P[8]/JN258926JS2012RVA/Hu/China/2012/G9P[8]H1JS2015RVA/Hu/China/2015/G9P[8]rj1609RVA/Hu/Brazil/1998/G9P[8]/FJ794019882009727051RVA/Hu/USA/2009/G9P[8]/HM773633BE00094RVA/Hu/Belgium/2009/G1P[8]/JN25890399UR14-17RVA/Hu/Japan/2014/G9P[8]/LC105455CNMC125RVA/Hu/USA/2011/G1P[8]/KT920683WI61RVA/Hu/USA/1983/G9P[8]/EF672625mcs13-07RVA/Hu/India/2007/G9P[6]/EU75396799BE2001RVA/Hu/Belgium/2009/G9P[6]/JQ993328116ERVA/Hu/India/1985/G9P[11]/FJ3612119392RMC321RVA/Hu/India/2001/AY033396WaRVA/Hu/USA/1974/G1P[8]/KT694949LLRLamb/China/1985/AY622998DS-1RVA/Hu/USA/1976/G2P[4]/HQ650126H20.05图11.RV的NSP5基因核苷酸序列进化分析48 南京医科大学硕士学位论文讨论对苏州地区2010~2016年的病毒性腹泻研究结果显示，G9P[8]型毒株在2010年已经存在，随后逐渐流行成为占据绝对优势的病毒株，取代了2010年和2011年流行的G3P[8]型和G1P[8]型。根据RV的11个基因片段核苷酸序列同源性分析（VP7-VP4-VP6-VP1-VP2-VP3-NSP1-NSP2-NSP3-NSP4-NSP5/NSP6），可将RV分为3个基因组：Wa-like基因组(Gx-P[8]-I1-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E1-H1)、DS-1-like基因组(Gx-P[4]-I2-R2-C2-M2-A2-N2-T2-E2-H2)和AU-1-like基因组(Gx-P[9]-I3-R3-C3-M3-A3-N3-T3-E3-H3)。G1、G3、G4、G9、G12和P[8]型都属于Wa-like基因组，G2和P[4]型别的毒株则属于DS-1-like基因组。AU-1-like基因组少见。这种分类机制能深入探究RV复杂的进化关系、跨宿主传播及不同基因片段之间的转换，有利于阐明RV分子进化机制。本研究中所有基因片段经RotaC2.0软件分析，结果显示JS2010~JS2016共7株毒株皆属于Wa-like基因组，具有G9-P[8]-I1-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E1-H1的分子特征。7株毒株的11个基因片段通过Blast工具检索后，都与人RV毒株同源关系较近，距离动物源性的RV毒株较远，提示跨宿主传播的可能性较小。本研究中7株毒株的VP1~3、VP6、NSP1~5基因片段与Wa基因组内的非G9型的参考毒株（包括G1、G3、G4型）亲缘关系较近，这些参考毒株的时间分布是2003年~2014年，提示可能存在组内基因片段重配。VP7基因片段分析显示，2株在2010年和2011年流行的G9型RV毒株与非洲株MRC-DPRU5123（G9P[8]）、韩国株CAU08-463（G9P[8]）同属于G9-III的小分支，该结果与韩国和非洲的报道一致[37,38]。另外5株G9毒株JS2012~JS2016属于G9-VI分支，与国内其他地区近年来流行的毒株的亲缘关系较近，结果相符[39,40]。JS2012~JS2016这5株毒株与来自美国及日本G9P[8]的距离也很近，核苷酸序列的同源性较高。但是近期俄罗斯的一篇报道显示，2011~2016年期间俄罗斯流行的G9型毒株均属于G9-III分支[41]，与本研究结果不一致。49 南京医科大学硕士学位论文Lopez等研究报道VP7基因对RV的表达和分布没有影响，但是对RV颗粒成熟至关重要[42]。不同基因型的RV其VP7基因的9个可变区（VR1~9）存在差异。随着突变的不断积累，使RV的多样性增加，产生变异株，变异株的毒力增强，则会成为流行株引起暴发和大规模流行。以G9的原型株WI61作为参考株，本研究中7株毒株氨基酸序列在VR1、VR3、VR4、VR5、VR7、VR8和VR9均检测到氨基酸突变。在VP7的系统进化树中，7株毒株分属在2个分支。VP7基因片段的氨基酸变异结果与毒株在系统进化树中的分支情况相符。JS2010和JS2011这2株毒株的在相应位点的氨基酸突变一致，而与之后在苏州地区流行的G9P[8]型毒株（JS2012~JS2016）的氨基酸变异有明显不同。JS2010和JS2011较近年来各地流行的G9-III型毒株的VR4区的65位点及VR8区的221位点氨基酸变异仍处于波动中。JS2012~JS2016与近年来各地流行的G9-VI型毒株相比，这5株毒株在绝大多数的位点的氨基酸突变较为稳定除外VR8区的221位点，这提示G9型毒株的VP7基因片段趋于稳定，变化速率较为缓慢。有研究报道，VP7基因片段上有6个不同的抗原决定簇，与中和反应有关[43]。与G9原型株WI61相比较，本研究中7株毒株的VP7基因片段的氨基酸序列中相应的抗原区（A、B、C、D和F）可检测到氨基酸变异。E抗原区相对比较保守，未检测到有氨基酸变异，这一结果与印度的报道相一致[44]。抗原区这些位点的氨基酸变异可能会使RV毒株更好的适应环境而生存或能让毒株逃避宿主免疫力。VP4基因被认为是主要的交叉中和抗原，在宿主感染RV时能刺激机体产生中和抗体。G9型RV毒株通常与P[4]、P[6]、P[8]和P[19]型组合。2010~2016年期间，苏州地区的RV毒株G9常与P[8]组合，G9P[8]型毒株占据绝对优势，还检测出少量G9P[4]型，未检测到G9P[6]型和G9P[19]型。这一结果与我国多地区的报道一致。本研究中6株毒株的VP4基因片段属于P[8]-3分支，与美国、日本、及我国的武汉、河北等多地区的P[8]型毒株均属于同一个分支，亲缘关系较近。仅有一株JS2012位于P[8]-4分支。这一结果可能是由于P[8]-3型比其他型别在病原体内的生存、致病及流行方面更占优势。这与近期我国和俄罗斯的50 南京医科大学硕士学位论文报道一致[40,41]。本研究中处于P[8]-3分支的6株毒株及P[8]-4分支上的1株毒株与P[8]的原型株B3458的氨基酸序列比较，有多个位点发生氨基酸变异。但是这7株的毒株与对应分支中近年来流行的P[8]型毒株氨基酸序列相比较，则氨基酸变异较为稳定，所有位点的变异结果一致。这提示，VP4基因片段趋于稳定，较少发生氨基酸变异。目前，许多研究者致力于非结构蛋白的研究，尤其是NSP4基因。有研究指出，NSP4基因对于RV的形成及毒力至关重要，它作为受体介导双层病毒颗粒（doublelayeredparticles，DLPs）穿过内质网膜并促进病毒颗粒的出芽过程[42,45]。与E1型的原型株Wa株的氨基酸序列进行比较，在NSP4基因片段的4个抗原位点（ASI~IV）中，在ASI和ASII分别检测到有3处位点发生氨基酸变异。这一结果与印度近期的报道不一致[44]。本研究中的7株毒株的NSP4基因在ASI的161位点和169位点发生氨基酸变异。这两个位点参与组成VP6和VP4的结合部位，能够促进RV的外层衣壳蛋白和突起的形成[46]。这两个位点的氨基酸变异可能对RV颗粒的形成及感染过程有影响。aa114~135是功能活跃的肽段，被称作是肠毒素结构域，能介导调节病理发病机制。在本研究中，7株毒株在该肽段位点未检测到氨基酸变异。G9型RV感染在世界各地均有报道，目前G9型已被公认为是引起病毒性腹泻的第五大流行基因型[47]。此外，很多研究报道了跨宿主传播的毒株，证实人RV毒株和动物来源的RV毒株可以发生重配，并促进RV多样性的形成[48,49]。本研究中7株G9P[8]型毒株的各个基因片段并不是都在一个分支上。基因突变可能是这些毒株产生多样性的原因。另外，Wa-like基因组内的RV毒株基因片段发生重配也有可能产生RV多样性。但是本研究中的所有基因片段均与人RV毒株的亲缘关系较近，没有发现人源型的RV与动物源型的RV的重配。RV感染尚没有特效的治疗药物，预防是控制RV感染的最有效的途径。LLR是单价羊G10P[15]RV疫苗，由我国兰州生物制品研究所于1984开发的且在我国国内使用。但是，系统进化树显示，本研究中的7株G9P[8]型毒株及参考株51 南京医科大学硕士学位论文的基因片段与LLR的亲缘关系都很远。所以关于LLR疫苗能否有效地保护机体及保护效果仍需进一步监测和评价。鉴于G9型RV在我国和其他许多国家的都是主要的流行株，因此需加强对G9型RV毒株的监测，通过全基因组分析来检测各基因片段的变化，有利于阐明RV的进化机制。52 南京医科大学硕士学位论文小结1.2010~2016年期间，苏州地区流行的G9P[8]型毒株均属于Wa-like基因组，分子分型特征为G9-P[8]-I1-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E1-H1；2.所有基因片段均与人RV毒株的同源关系较近，跨宿主传播可能性小。7株G9P[8]型的部分基因片段与G1、G3、G4型RV毒株的同源性较高，可能是由于突变或组内基因片段重配；3.本研究中的7株G9P[8]型毒株的所有基因片段与疫苗株LLR的距离都很远；4.苏州地区RV感染持续存在，毒株处于缓慢变化中，应长期监测，警惕变异株的出现，关注流行株的变化趋势。53 南京医科大学硕士学位论文参考文献[1].NakagomiT,NakagomiO.Acriticalreviewonaglobally-licensed,live,orally-administrable,monovalenthumanrotavirusvaccine:Rotarix[J].ExpertOpinBiolTher.2009,9(8):1073-1086.[2].MatthijnssensJ,CiarletM,McDonaldSM,etal.UniformityofrotavirusstrainnomenclatureproposedbytheRotavirusClassificationWorkingGroup(RCWG)[J].ArchVirol.2011,156(8):1397-1413.[3].MatthijnssensJ,CiarletM,RahmanM,etal.RecommendationsfortheclassificationofgroupArotavirusesusingall11genomicRNAsegments[J].ArchVirol.2008,153(8):1621-1629.[4].DoanYH,NakagomiT,AgbemabieseCA,etal.ChangesinthedistributionoflineageconstellationsofG2P[4]RotavirusAstrainsdetectedinJapanover32years(1980-2011)[J].InfectGenetEvol.2015,34:423-433.[5].NakagomiT,NguyenMQ,GauchanP,etal.EvolutionofDS-1-likeG1P[8]double-genereassortantrotavirusAstrainscausinggastroenteritisinchildreninVietnamin2012/2013[J].ArchVirol.2017,162(3):739-748.[6].TateJE,BurtonAH,Boschi-PintoC,etal.2008estimateofworldwiderotavirus-associatedmortalityinchildrenyoungerthan5yearsbeforetheintroductionofuniversalrotavirusvaccinationprogrammes:asystematicreviewandmeta-analysis[J].LancetInfectDis.2012,12(2):136-141.[7].AgocsMM,SerhanF,YenC,etal.WHOglobalrotavirussurveillancenetwork:astrategicreviewofthefirst5years,2008-2012[J].MMWRMorbMortalWklyRep.2014,63(29):634-637.[8].DuanZJ,LiuN,YangSH,etal.Hospital-BasedSurveillanceofRotavirusDiarrheainthePeople'sRepublicofChina,August2003-July2007[J].JInfectDis.2009,200(1):167-173.54 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南京医科大学硕士学位论文文献综述A组轮状病毒的研究进展摘要：轮状病毒（Rotavirus,RV）是引起5岁以下儿童急性病毒性腹泻的主要病原体，其型别多样，致病机制复杂。本文主要对RV的病原学、流行病学、发病机制等加以综述，同时简要介绍近年来A组RV的研究进展及疫苗使用状况。关键词：A组轮状病毒；腹泻；复制与致病机制；疫苗1973年，澳大利亚学者Bishop及其同事通过电子显微镜观察急性腹泻患儿的十二指肠活检标本及粪便标本，首次发现并报道了该病毒[1]。1975年，正式命名为轮状病毒（Rotavirus,RV）。流行病学数据表明RV是引起世界范围内5岁以下儿童病毒性腹泻的主要病原体，35%~50%的腹泻住院儿童是因RV感染。在美国，每年大约有20~40例患者死于RV感染，全世界每年由于RV感染而死亡的病例大约有453000人[2]。迄今为止，已经在人和许多其他多种动物的粪便中检测到RV。病毒结构和功能完整的RV颗粒形似车轮状，为正二十面体的无包膜的双股正链RNA（double-strandedRNA,dsRNA）病毒[3]，电镜下观察，其光滑的外表面上向外辐射出钉状突起。RV基因组包含11个不连续的基因片段，分别编码6个结构蛋白（VP1~4、VP6和VP7）和6个非结构蛋白（NSP1~5/6）。具有致病性的RV有三层同轴的病毒衣壳蛋白（见图1）：VP1~3是组成病毒颗粒的核心蛋白，其包裹着病毒基因组和与病毒复制有关的酶类[4]；VP6以三聚体形式构成病毒的中层衣壳蛋白，呈辐射状排列，其与RV的组和亚组抗原特异性有关；VP7与VP4组成外层衣壳蛋白，VP7组成外层衣壳蛋白相对光滑的表面，VP4形成表面突起，两者均与诱导宿主发生免疫应答产生保护性中和抗体有关[5]。其中，VP4还与病毒的附着和毒性密切相关。在肠道环境内，VP4经胰蛋白酶裂解形成VP5*和VP8*两个肽段。VP8*靠近氨基端，形成表面突起的头部，该肽段含有VP4主要的抗原位点，参与特异性中和反应。VP5*靠近羧基端，形成颈部和基底部，60 南京医科大学硕士学位论文该肽段参与在各型之间产生交叉反应。这两种多肽的形成能增加病毒对宿主的易感性[6]。图1.RV的结构（引自参考文献[7]）分类及命名根据蛋白衣壳构成、基因组结构和复制方式的差异，轮状病毒被划分为呼肠病毒科中独立的轮状病毒属。不同组、亚组、血清型和基因型的RV存在差异。依据VP6基因序列和抗原特异性的不同，RV至少分为8组A~H[8-10]。其中，4组RV（A~C和H）可引起人类发病，又以A组最为常见。有报道称，人类RV感染超过90%是由A组引起的。而D~G仅感染动物。根据VP6亚组特异性差异，可将RV分为4个亚组（Ⅰ、Ⅱ、Ⅰ+Ⅱ和非Ⅰ非Ⅱ）[11]。外层衣壳蛋白的抗原特异性VP7和VP4分别决定了RV的G、P血清型。目前研究发现至少存在15个G血清型。VP4单克隆抗体的获取较为困难且常有交叉反应，因此较少用血清学方法鉴定VP4。根据VP7和VP4基因片段的核苷酸序列差异，可将RV分为不同的G、P基因型。目前，已报道有35个G基因型和50个P基因型[12]。6个G基因型（G1、G2、G3、G4、G9和G12）和3个P基因型(P[4]、P[6]和P[8])在全球范围内较为流行[13,14]。A组RV中有6种病61 南京医科大学硕士学位论文毒株尤为常见，引起约90%的RV感染，分别是G1P[8]、G2P[4]、G3P[8]、G4P[8]、G9P[8]和G12P[8][15,16]。2008年Matthijnssens等提出了根据RV的11个基因片段(VP7-VP4-VP6-VP1-VP2-VP3-NSP1-NSP2-NSP3-NSP4-NSP5)的核苷酸序列的同源性对RV进行全基因组序列的分类方法(Gx-Px-Ix-Rx-Cx-Mx-Ax-Nx-Tx-Ex-Hx)[17]。该分类方法已得到广泛应用，能更为准确地阐述RV的演化关系、种间传播及组内基因片段的转换。流行病学RV在全世界普遍存在并广泛流行，每一个5岁儿童都至少曾经感染过一次RV。在2003年时，有研究报道全球每年约有114000000例5岁以下儿童感染RV，其中门诊病例达24000000人次，住院病例达2300000人次[18]。在2013年，研究数据显示全球至少有200000例5岁以下儿童死于RV感染。尽管全球腹泻住院儿童的RV发病率相近（30%~50%），但90%的重症病例是发生在经济水平较低的发展中国家，可能是由于其经济落后、医疗卫生资源匮乏、预防和治疗水平差等因素造成的[19]。RV在人和动物中均可以引起流行，但大多数情况不引起临床发病，仅表现为隐性感染。儿童和成人RV感染的潜伏期存在差异，儿童潜伏期是24~78小时，成人大约是1~4天[20]。感染后大多数患者发病持续3~7天即可缓解恢复，少数重症病例可持续发病14天[21]。免疫缺陷者由于某些先天性免疫缺陷性疾病发病持续时间更长。RV的易感人群是5岁以下儿童，其感染与性别无关。主要的传播途径是粪-口传播，通过接触污染的水源和食物引起感染；有研究发现也可能经由呼吸道途径传染[22]。传染源主要是患者、无症状感染者和病毒携带者。无症状感染者和病毒携带者在出现感染症状之前就开始排泄病毒，每克粪便的病毒排泄量可达1010~1011，而RV颗粒只要10颗~100颗借由传播途径而感染另一个人[20]。病毒排泄的高峰期主要发生在感染后的第3天，7天后病毒排泄量开始下降。免疫缺陷患者和5岁以下儿童大约在临床症状出现5天前就可以在粪便中检测到病毒颗粒，病毒排泄期可持续达数周。通常情况下，临床症状越严重，62 南京医科大学硕士学位论文RV排泄时间持续越长[23]。RV流行在热带地区国家无季节性趋势，全年散在发病；而在温带地区国家有明显的季节性，其流行的高峰期主要是在每年的秋冬季[24]。RV季节性的机制尚不明确，可能与病毒的生存环境温度、湿度等变化有关。病毒复制及发病机制RV的复制主要发生在宿主的小肠粘膜上皮细胞的胞质中[25]，其三层衣壳蛋白有利于抵抗胃内的酸性环境和肠道的消化酶作用。RV颗粒的VP4与细胞吸附和穿透密切相关，其在肠道胰蛋白酶作用下裂解为VP5*和VP8*两个多肽。在VP8*的介导下，RV可识别和吸附宿主细胞表面不同的多聚糖受体。对于动物而言RV的VP8*主要的细胞表面受体是神经节苷脂1（Monosialotetrahexosylganglioside1，GM1），而在人类，RV的VP8*的受体主要为血型组织抗原（histo-bloodgroupantigens，HBGAs），其他还包括整合素和热休克蛋白70（Heatshockproteins70，HSP-70）等[26,27]。在初步识别后，VP5*和VP7与聚集在脂质双分子层上的协同受体分子相互作用，通过内吞作用进入小肠绒毛的肠上皮细胞[28]。这种核内体囊泡内Ca+浓度极低，促使病毒颗粒脱去外层衣壳蛋白，向胞质中释放出含有VP1~VP3和VP6的双层蛋白颗粒（doublelayeredparticle，DLP）启动转录过程。病毒mRNA通过DLP的顶角通道从内核运输到病毒颗粒表面，用作复制过程中翻译成蛋白或合成新的RNA的模板。在病毒质中，合成的RNA组装形成新的DLPs[29]。NSP4是内质网特异性的跨膜糖蛋白。在病毒装配过程中，NSP4作为细胞内受体，与VP4相互作用，共同介导病毒外层衣壳装配和病毒内质网出芽过程。此外，NSP4还能调节胞浆内Ca+浓度，使其浓度增高，有利于病毒复制过程[30,31]。在内质网内，可以观察到短暂的有包膜的病毒颗粒。成熟后，病毒颗粒表面包膜消失，通过细胞溶解或高尔基体依赖的非经典的膜泡运输机制释放到细胞外。RV的复制过程示意图见图2。63 南京医科大学硕士学位论文图2.RV复制的示意图（来自参考文献[7]）宿主感染RV后，病毒颗粒主要定植在小肠，引起消化道症状，还可通过肠道传播至其他组织器官引起病变。宿主和病毒两方面因素均影响RV的感染过程和感染后的症状表现。影响临床表现最主要的宿主因素是年龄。3月龄以下儿童，因从从母乳中获得sIgA抗体或胎传抗体尚未完全分解，因而感染RV的机会较小[32]。3月龄至24月龄的儿童，随着体内母体抗体滴度的下降而感染的机会增高[25]。此外，接种疫苗的年龄也与感染后疾病的严重程度有关。RV通过多种机制诱发宿主腹泻。以往观点普遍认为RV感染破坏肠上皮细胞结构、乳糖酶活性下降或含量降低致乳糖吸收功能障碍、细菌分解乳糖致肠道产物堆积等原因引起的渗透性腹泻[33]。近年来证实RV侵入宿主消化道后，定植在肠绒毛上皮细胞，引起病理改变的同时亦可造成分泌性腹泻。NSP4是一种肠毒素，从受感染的肠细胞释放出来后刺激肠嗜铬细胞（enterochromaffincells，ECs）释放5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT），激活5-HT受体经传入神经将神经冲动传入肠肌丛，从而调节胃肠蠕动，诱发产生恶心和呕吐[34]。NSP4诱64 南京医科大学硕士学位论文导细胞内液的Ca+浓度增加，Na+和Cl-向细胞外转运，引起腹泻。NSP4可阻止紧密连接蛋白ZO-1锚定，破坏细胞骨架和肠上皮细胞间紧密连接，是RV腹泻早期的重要机制[35]。NSP4还可抑制Na+耦合的葡萄糖和亮氨酸的同向转运，使Na+吸收减少，水生成增加，引起腹泻。RV的致病机制包括肠道神经系统的激活和某些生物活性物质（神经激肽-1）的释放均在动物实验中得到证实，可能是RV感染的重要环节，参与了RV腹泻的发病过程，为RV的诊治提供了新思路。轮状病毒疫苗目前，RV感染尚无特效治疗药物，预防是控制RV感染最有效的途径。因此，高效经济的疫苗研发具有重要意义。2009年，世界卫生组织推荐使用Rotarix和RotaTeq两种疫苗，尤其是在5岁以下儿童腹泻死亡率超过10％的国家中更应该广泛使用[36]。Rotarix是单价口服活疫苗，由葛兰素史克公司开发，使用G1P1A[8]人型减毒活疫苗，对大多数血清型轮状病毒具有交叉免疫。Rotarix疫苗需要接种2次。接种完成后，不同地区的抗RV的IgA抗体阳转率存在差异，新加坡儿童阳转率为82.0%~93.0%，印度48.7%~67.4%，芬兰83.7%~90.5%[37]。RotaTeq是五价口服减毒活疫苗，由默克公司开发，可表达人病毒血清型G1、G2、G3、G4和P[8]。RotaTeq疫苗需要接种3次，推荐接种的年龄是2、4、6月龄。接种完成后，不同地区的抗RV的IgA抗体阳转率也存在差异，美国和芬兰儿童阳转率为95.5%，亚洲地区87.8%~97.0%，非洲地区73.8%~82.5%[38]。由于RV的多样性，要求RV疫苗对各型病毒具有交叉保护作用。上述两种疫苗在很多地区对不同型别RV的预防作用的有效性差异无统计学意义。但是在经济发展水平较高的地区和经济发展相对落后的地区疫苗的保护率有明显差异[39,40]。在经济发展水平较高的地区，Rotarix对RV的保护率为87%~94%，RotaTeq为75%~83%[41]。而在经济发展落后的地区，Rotarix对RV的保护率下降到47%~59%，RotaTeq为37%~70%[42]。很多国家进行了疫苗上市后的效果再评价，呈现出与上述相同的趋势，表明疫苗有效性与区域经济发展水平密切相关。所65 南京医科大学硕士学位论文以是否在腹泻儿童死亡率高的地区增加RV疫苗的使用成本还需进一步探究和评估。LLR是单价羊G10P[15]口服减毒活疫苗，由我国兰州生物制品研究所于1984年开发。该疫苗每年服用1次，主要应用于6月龄~3岁婴幼儿。该疫苗可诱导产生抗G1、G2、G3和G4型RV抗体，免疫儿童的抗体阳转率超过50%，对RV腹泻的保护效果为78%。到目前为止，在LLR疫苗的使用过程中尚未发现严重的不良反应。随着分子生物学技术的发展，人们对RV分子结构及致病机制的认识更加深入，为RV腹泻的诊断、治疗提供了新思路。RV型别不断发生演变，且存在地域差异，需加强区域监测和分子流行病学研究，全面了解其流行现状，并在疫苗研发设计上引入当前流行型别的中和抗原，以增强疫苗的保护效果。参考文献[1].BishopRF,DavidsonGP,HolmesIH,etal.Virusparticlesinepithelialcellsofduodenalmucosafromchildrenwithacutenon-bacterialgastroenteritis[J].Lancet.1973,2(7841):1281-1283.[2].TateJE,BurtonAH,Boschi-PintoC,etal.2008estimateofworldwiderotavirus-associatedmortalityinchildrenyoungerthan5yearsbeforetheintroductionofuniversalrotavirusvaccinationprogrammes:asystematicreviewandmeta-analysis[J].LancetInfectDis.2012,12(2):136-141.[3].McClainB,SettembreE,TempleBR,etal.X-raycrystalstructureoftherotavirusinnercapsidparticleat3.8Aresolution[J].JMolBiol.2010,397(2):587-599.[4].LuX,McDonaldSM,TortoriciMA,etal.MechanismforcoordinatedRNApackagingandgenomereplicationbyrotaviruspolymeraseVP1[J].Structure.2008,16(11):1678-1688.[5].DormitzerPR,SunZY,WagnerG,etal.TherhesusrotavirusVP4sialicacid66 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南京医科大学硕士学位论文攻读学位期间发表论文1.徐承,付建光,蒋翠莲,艾静,姚萍,鲍昌俊,朱叶飞.GII.P7/GII.14型诺如病毒暴发的分子特征分析.国际病毒学杂志2017,24(5):300-304.2.FuJG,ShiC,XuC,LinQ,ZhangJ,BaoCJ,HuoX,ZhuYF,AiJ,XingZ.OutbreaksofAcuteGastroenteritisAssociatedwithaRe-emergingGII.P16-GII.2NorovirusintheSpringof2017inJiangsu,China.PLoSOne2017,12(12):e0186090.3.XuC,FuJG,AiJ,ZhangJ,LiuC,HuoX,BaoCJ,ZhuYF.PhylogeneticanalysisofhumanG9P[8]rotavirusstrainscirculatinginJiangsu,Chinabetween2010and2016.JMedVirol,2018,doi:10.1002/jmv.25214.71 南京医科大学硕士学位论文致谢硕士三年时光，转眼间匆匆而过，回顾往昔三年的实验室生活，感慨万千！我在众多老师、同学和亲友的大力支持下一路成长收获满囊，在论文即将付梓之际，我要向他们表达我最诚挚的谢意！本研究是在尊敬的导师朱叶飞老师的亲切关怀和悉心指导下完成的，从课题的构思、设计、实施到论文的完成，都离不开朱老师的悉心指导和精心批阅。恩师一丝不苟的治学精神、严谨缜密的科研思路、实事求是的学术态度、清正廉明的为人原则都给我留下了非常深刻的印象，让我终生受益，在此谨向导师致以崇高的敬意和衷心的感谢！衷心地感谢付建光老师在各个方面给予本研究的不吝指导，提出了许多建设性的意见，为我的科研学习提供了大力的帮助。从实验的设计、文章的发表及论文的撰写都离不开您的支持与帮助。回首三年与您共处的实验生活，受益良多。您科研严谨、生活乐观、为人谦和，是我学习的楷模。在此向您致以衷心地谢意！衷心感谢南医大二附院检验科全体工作人员和江苏省疾病预防控制中心急传所全体工作人员对我科研工作的支持与帮助，是你们给我带来了一个积极向上的学习环境和科研氛围。愿你们身体健康，一切顺利！还要感谢这三年来与我互勉互励的诸位同学，感谢孙利师姐、夏艳艳师姐、苏迎迎师妹和蔡潇潇师妹在学业和生活上给予的无私帮助，是你们的陪伴和鼓励让我变得坚强，勇敢向前。愿你们前程锦绣，万事顺心！同时也要深深地感谢我的家人。无论我是处在顺境还是逆境，是你们的关爱、支持和包容一直陪伴我，你们是我刻苦学习、努力工作的坚强后盾。祝愿我的家人永远健康快乐！感谢所有给予我帮助的老师、朋友和家人！谨以此文献给你们！72
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