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1、吉西他滨对人非小细胞肺癌A549细胞增殖与凋亡的【摘要】目的研究吉西他滨体外对人非小细胞肺癌A549细胞增殖及凋亡的作用。方法应用MTT法，流式细胞仪，AnnexinVPI双标法，Tunel法等多项方法，体外研究吉西他滨对A549细胞的促凋亡作用；采用免疫组化的方法，观察药物作用后bcl2表达的变化。结果吉西他滨对A549细胞生长具有抑制作用，并有促凋亡效应，对细胞周期的影响表现为S期的阻滞，药物处理的细胞凋亡，可见伴有bcl2的下调。结论吉西他滨可抑制人非小细胞肺癌A549细胞的生长，并诱导细胞发生凋亡，其诱
2、导凋亡是吉西他滨抗肿瘤作用机制的原因之一，而且凋亡与bcl2的表达有一定关系。【关键词】吉西他滨细胞凋亡非小细胞肺癌bcl2 0引言 非小细胞肺癌的预后比较差，尽管现在的治疗不断发展，生存率提高的还是很少[1]。凋亡受阻是肿瘤发生的主要原因,诱导肿瘤细胞分化和凋亡已成为当前肿瘤治疗的热点。吉西他滨（gemcitabine,2′,2′difluoro2′deoxycytidine,dFdC）是一种新型的脱氧胞苷类似物和核苷还原酶抑制剂，对多种实体瘤具有良好的抗肿瘤活性[2]。但是体外研究其对非小细胞肺癌的
3、凋亡作用及其凋亡机制的研究尚且不多。 1材料和方法 1.1药物与试剂 吉西他滨（健择,生产厂家：LILLYFRANCES.A,注册证号：H20020180），RPMI1640培养基，小牛血清为Gibico公司产品，bcl2单克隆抗体购于北京晶美公司，HEPES，四氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO），碘化丙啶（PI），免疫组化试剂盒，AnnexinVPI双标凋亡试剂盒均为北京中山生物公司产品。 1.2细胞培养 人肺腺癌细胞A549由同济医院呼吸内科重点实验室冻存。细胞用含10%小牛血清的RPMI16
4、40培养液在5%CO2,37℃，饱和湿度的细胞培养箱培养,细胞呈贴壁生长,用0.25%的胰酶和0.02%EDTA(1∶1)消化传代，用于实验的细胞均处于指数生长期。 1.3细胞体外生长活性的检测（MTT法） 取指数生长期的培养细胞,用0.25%胰蛋白酶消化，以1×104/孔的密度接种于96孔板，每孔设3个复孔，以不含细胞的培养液做空白对照。贴壁后，加入不同浓度的吉西他滨,按常规方法操作后，用酶联免疫仪测490nm处的吸光度（A490）值。 1.4流式细胞仪分析细胞周期 各组药物处理细胞72h后，进行细胞消化，
5、收集所有悬浮细胞。调整细胞密度为5×105～1×106个/ml,取1ml细胞，1000r/min离心5min，去培养基。细胞收集后，加入70%乙醇置于-20℃冰箱固定过夜,PBS洗两遍。依次加入50μg/ml碘化丙啶（propidiumiodide,PI）和1mg/mlRNaseA,室温避光染色30min后上机检测。 1.5AnnexinVPI双标记法分析细胞凋亡率 如上法收集药物处理72h后的细胞，按试剂盒操作说明书操作后，上流式细胞仪检测。采用CELIQUEST软件分析早期细胞凋亡率。 1.6TUNEL法
6、 制作不同浓度不同时间作用后的细胞爬片,按试剂盒操作说明书操作。 1.7bcl2癌基因产物表达检测 将各实验组和对照组在不同药物浓度下分别培养24h,48h,72h后，制成盖玻片培养细胞标本，按SP试剂盒说明书操作，用图像分析仪进行分析。 1.8统计学分析 数据以±s表示，用t检验分析差异显著性，采用Pearson相关分析进行相关检验，运用SPSS10.0统计软件分析数据。 2结果 2.1吉西他滨对A549细胞生长增殖能力的影响 吉西他滨不同浓度对细胞的抑制率可按公式计算:肿瘤细胞的生长抑制率(%)
7、=(1-实验组吸光度值/对照组吸光度值)×100%,可见各浓度组对A549细胞均有抑制作用，呈时间、剂量依赖性，差异有显著性(P<0.05），见图1。 图1吉西他滨对人小细胞肺癌细胞A549生长抑制作用（略） 2.2吉西他滨对A549细胞周期的影响 在药物作用72h，随着药物浓度的增加，G0/G1期细胞比例不断增高，处于S期细胞比例降低，对细胞周期有明显影响，将细胞阻滞与G0/G1期，见表1。 表1不同浓度吉西他滨对A549细胞周期的影响（略） 2.3AnnexinVPI联合双染测凋亡率 结果显示
8、，作用72h后，各浓度吉西他滨处理的细胞的凋亡率分别为(4.97±0.4)%、(8.06±0.7)%、(14.67±0.5)%、(30.59±1.1)%、(38.88±0.8)%、(41.32±1.2)%相关性分析显示药物浓度与凋亡发生呈正相关，即随着药物浓度增加细胞凋亡增加。 2.4TUNEL检测 阴性组仅见蓝灰色的凋亡阴性染色吉西他滨处
