多重耐药大肠埃希菌16s rrna甲基化酶、氨基

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1、多重耐药大肠埃希菌16SrRNA甲基化酶、氨基【摘要】目的了解多重耐药大肠埃希菌(ECO)氨基糖苷类药物耐药机制。方法采用PCR检测20株多重耐药ECO菌11种16SrRNA甲基化酶和氨基糖苷类修饰酶基因。结果1株检出16SrRNA甲基化酶基因(5.0%)，并为新亚型；16株检出氨基糖苷类修饰酶基因(80.0%)。15号株rmtB基因测得序列翻译成氨基酸序列与美国核酸库(GenBank)已登录的rmtB氨基酸不同，为新亚型。结论本组多重耐药ECO菌氨基糖苷类耐药机制与产16SrRNA甲基化酶和产氨

2、基糖苷类修饰酶相关。多重耐药ECO菌存在新的氨基糖苷类药物耐药机制。【关键词】大肠埃希菌；16SrRNA甲基化酶；氨基糖苷类修饰酶ABSTRACTObjectiveToinvestigatemechanismofaminoglycosideresistanceinmultidrugresistantEscherichiacoli.MethodsThegenesof11kinds16SrRNAmethylaseandaminoglycosidemodifyingenzymeserasechain

3、reaction(PCR).ResultsIn20strains,1straincarried16SrRNAmethylasegene(rmtB),16strainsinoglycosidemodifyingenzymes.ThereinoacidsinthesequenceofRmtBofNo.15.AsignificantdifferencetherestthatlandedinGenBank,inoglycosideresistancemechanismoftheEscherichiaco

4、liethylaseandaminoglycosidemodifyingenzymes.TheneechanismofaminoglycosideresistanceultidrugresistantstrainsofEscherichiacoli.KEYethylase;Aminoglycosidemodifyingenzymes大肠埃希菌(ECO)是条件致病菌，对β内酰胺类和氨基糖苷类在内的常用抗菌药物呈多重耐药性。有关ECO菌耐药机制研究，国内报道β内酰胺类耐药机制较多，报道氨基

5、糖苷类耐药机制较少，并仅限于6种氨基糖苷类修饰酶基因存在情况［1～4］。近年来，国外学者发现了氨基糖苷类耐药新机制——16SrRNA甲基化酶(编码基因为rmtA、rmtB、rmtC、rmtD和armA)［5～8］。为尽可能了解淮安市第一人民医院ECO菌临床分离多重耐药株氨基糖苷类药物各种耐药相关基因存在状况，我们检测了16SrRNA甲基化酶与氨基糖苷类修饰酶基因rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、armA、aac(3)I、aac(3)II、aac(6′)Ib、aac(6′)II、ant

6、(3")I和ant(2")I，现报告如下。1材料与方法1.1菌株20株ECO菌株均分离自2007年1～7月间淮安市第一人民医院住院患者标本。标本分别为尿液7株、痰液5株、血液5株、脓液3株；患者年龄2～75岁，男7例、女13例。全部菌株均使用VITEK32全自动微生物鉴定系统鉴定菌种。标准菌株为大肠埃希菌ATCC25922。1.2抗菌药物敏感性试验用KB法测定18种抗菌药物的敏感性。根据美国CLSI2006年版标准进行敏感性判断。头孢哌酮/舒巴坦参照头孢哌酮。20株多药耐药临床分离ECO菌对

7、18种抗菌药物的敏感性见表1。1.4细菌处理挑纯培养菌落置0.5ml离心管内(内预置200ng/ml蛋白酶K溶液200μl)，56℃水浴2h，改95℃水浴10min，加入Chelex10040μl，离心(15000r/min)30s，上清液即为基因检测的模板液，-20℃冰箱保存备用。1.5基因检测全部采用PCR法，靶基因引物序列和目的产物长度见表2。各种靶基因PCR扩增体系均为：每反应体系P1、P2引物各0.5μmmol/L，dNTPs各200表120株ECO菌18种抗菌药物的敏感性表2靶基因P

8、CR引物序列总反应体积20μl(其中模板液5μl)。PCR扩增产物>500bp热循环参数均为：93℃预变性2min，然后93℃　60s→55℃　60s→72℃　60s，循环35周期，最后一个72℃延长至5min。PCR扩增产物<500bp热循环参数均为：93℃预变性2min，然后93℃　30s→55℃　30s→72℃　60s，循环35周期，最后一个72℃延长至5min。扩增产物作2%琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶电泳成像仪下观察，并纪录结果。耐药基因检测试剂盒、靶基因PCR引